La phosphorylation de FXR par la PKA sur ses sérines en position 325 et 357 régule son activité

L’action de FXR étant modifiée en présence d’activateurs de la PKA (analogue de l’AMPc ou glucagon), il est possible qu’il soit directement ciblé par cette kinase. Afin de vérifier cette hypothèse, les isoformes murines FXRα1 et FXRα3 ont été utilisées, sous forme de protéines recombinantes, pour un test de phosphorylation in vitro. Ces expériences ont montrées un transfert de phosphate radioactif, dépendant de la PKA, sur les deux isoformes de la protéine FXR (Figure 49 panel A). Celui-ci s’effectue à une intensité comparable à celle observée en utilisant la kinase PKCα, auparavant identifiée comme ciblant FXR (Gineste et al., 2008)(Figure 49 panel B). Enfin, GSK3β, une kinase également activée au cours du jeûne, n’est pas capable de phosphoryler FXR (Figure 49 panel C). Nous pouvons donc conclure que lors du jeûne, FXR peut être phosphorylé directement par la PKA suite à l’activation de la voie glucagon/AMPc, à l’inverse la GSK3β ne semble pas pouvoir le modifier. La PKA est capable de phosphoryler les isoformes 1 et 3 de FXR, elle ne cible donc pas des sites situés spécifiquement au niveau des séquences protéiques qui différencient ces deux isoformes.

Figure 49: Identification in vitro de la phosphorylation directe de FXR par la PKA. Les protéines recombinantes purifiées des isoformes murines 1 et 3 de FXR et un ATP radio-marqué sont utilisés comme substrats dans des réactions de phosphorylation in vitro. Les actions de kinases recombinantes purifiées PKAca (A), PKCα (B) et GSK3β (C) sont testées. Les protéines MPB et GyS (glycogène synthase) servent de contrôles positifs. Les produits de réactions ont été détectés par autoradiographie après séparation sur un gel SDS-PAGE 10%.

De nouvelles expériences de phosphorylation in vitro par la PKA sur la protéine mFXRα1 ont été réalisées en utilisant un ATP non radio-actif. Les protéines correspondantes ainsi que celles contrôles (mêmes conditions mais sans ajout de la kinase) ont été analysées par spectrométrie de masse. Ceci a permis d’identifier les peptides de FXR phosphorylés par la PKA dans ce contexte in vitro (Figure 50 panel A-E). Les sites mis en évidence correspondent à trois sérines identifiées par bioinformatique comme faisant partie d’un motif consensus reconnu par la PKA, ainsi que deux sérines identifiées de novo. Ces sérines sont situées respectivement en position 132, 151, 357 et 114, 325 sur la séquence protéique du FXRα1 murin (Figure 50 panel F).

Figure 50: Captures d’écran des spectres de masses des phospho-peptides de FXR ciblés par la PKA. Les spectres de masses des phospho-peptides identifiés à partir de la protéine mFXRα1 en présence de la PKAca sont les suivants : (A) S+80GISDEYIPTMFSFYK, (B) MAAAS+80AGR, (C) GS+80AVEAMFLR, (D) AS+80GYHYNALTCEGCK et (E) S+80ITKNAVYK. (Les expériences de spectrométrie de masse et leurs

analyses ont été réalisées par le LSMBO de l’université de Strasbourg) (F) Répartition des sites ciblés par la

PKA identifiés sur la séquence protéique de mFXRα1. * indique les phospho-peptides contenant un motif

NetPhosK du serveur CBS (Center for Biological Sequence analysis / http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) et Scansite Motif Scanner (Massachussetts Institute of Technology / https://scansite4.mit.edu/4.0/#home ).

Afin d’évaluer l’impact de l’activation de la PKA sur l’activité transcriptionnelle de FXR, un test de trans-activation dans lequel FXR est exprimé sous la forme d’une protéine fusionnée avec le domaine de fixation à l’ADN de la protéine de levure Gal4 (essai simple hybride) est réalisé (Figure 51 panel A). Ceci permet de visualiser uniquement le niveau d’activation de la transcription induite par FXR sur un plasmide rapporteur dans lequel l’élément de réponse du Gal4 (UAS, Upstream Activating Sequence) contrôle l’expression du gène de la luciférase. Ce système permet d’exclure tout les effets qui pourraient être associés à une modification de la capacité de FXR : à s’hétérodimériser avec RXR, à se fixer sur l’ADN ou dépendant de son HRE. Cette expérience montre que la stimulation seule de la PKA par la forskoline (un activateur de l’adénylate cyclase) n’affecte pas l’activité transcriptionnelle de FXR. Par contre, la trans-activation induite par le GW4064 est potentialisée en présence de la forskoline (Figure 51 panel A). Les mêmes profils sont observés dans un système où FXR est exprimé sous une forme native (mFXRα1) et où le gène rapporteur est sous contrôle de trois séquences IR-1, l’élément de réponse consensus de FXR (Figure 51 panel B). Enfin, ce dernier système a été utilisé en exprimant FXR sous des formes mutantes pour lesquels les sites, précédemment identifiés comme ciblés par la PKA, ne peuvent plus être phosphorylés. Pour cela, les séquences codant pour les différentes sérines ont été modifiées afin qu’elles expriment à la place des alanines. Seules les mutations des sérines S325 et S357 diminuent la potentialisation de l’activité transcriptionnelle de FXR induite par le GW4064 en présence de forskoline. Cet effet est partiel lorsque un seul de ces deux sites est muté, alors que la potentialisation est complétement abolie lorsque les deux sites sont mutés simultanément (Figure 51 panel B). Les autres mutations des sites précédemment identifiés n’ont aucun effet (Figure 51 panel C). Il est à noter que ces expériences sont réalisées dans une lignée cellulaire, les HEK293, n’exprimant pas FXR de manière endogène, seules les actions des formes mutantes sont donc mesurées. De plus, les mutations réalisées n’affectent ni la stabilité de la protéine FXR (Figure 51 panel D), ni la réponse au GW4064 seul (Figure 51 panel B). Les effets observés ne sont donc pas le fait de changements structuraux impactant FXR qui auraient pu être introduits par les différentes mutations. Nous pouvons conclure que les sérines S325 et S357 sont nécessaires et suffisantes à la potentialisation de l’activité transcriptionnelle de FXR par la voie glucagon/AMPc et la PKA.

Figure 51 : La protéine kinase A régule l’activité transcriptionnelle de FXR. (A) Potentialisation de

l’activité transcriptionnelle de FXR : « one-hybrid assay » les cellules HEK293 sont transfectées avec les

plasmides indiqués et traitées pendant 6 heures. (B) Les sérines en position 325 et 357 sont nécessaires à la

potentialisation de l’activité transcriptionnelle de FXR par la PKA. Mêmes conditions que (A). (A) et (B), les

résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=6) et sont exprimés par rapport à l’activité luciférase basale mesurée dans les conditions non traitées arbitrairement fixée à 1. Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. (C) Evaluation des

effets des mutants non modifiables des différents sites de phosphorylation identifiés par spectrométrie de masse.

Mêmes conditions que (A) Les valeurs de l’axe Y correspondent aux différentiels des activités luciférase mesurées entre les conditions FSK+GW4064 et GW4064. Les données sont représentées par rapport à la condition utilisant le plasmide exprimant la forme non mutée de FXR (mFXRα1) arbitrairement fixée à 1. Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. (D) : Stabilité protéique des formes mutantes de FXR. Les expressions protéiques en FXR des cellules HEK293 transfectées comme décrit précédemment ont été analysées par western blot.

4) La phosphorylation de FXR par la PKA sur ses sérines en position 325 et