Phosphorylation de Chk1 sur les résidus sérine 317/345 par ATR

a. Mise en évidence de la phosphorylation de Chk1 par ATR

En 1996, les travaux de Walworth et Bernards montrent pour la première fois que l’induction de dommages de l’ADN entraine une phosphorylation de Chk1 chez S. pombe (Walworth and Bernards, 1996). Des observations similaires ont ensuite été décrites chez l’homme et chez le Xénope (Sanchez et al., 1997). De plus, il a été montré que la phosphorylation de Chk1 diminue avec la concentration en cafféine (Kumagai et al., 1998). La cafféine inhibant l’activité d’ATR et d’ATM mais pas celle de Chk1, Chk1 est alors proposée comme une cible potentielle d’ATR/ATM (Moser et al., 2000). La phosphorylation de Chk1 par ATR sur les résidus serine 317 et serine 345 (ou en sérine 344 chez le Xénope) a ensuite été démontrée

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expérimentalement (Capasso et al., 2002; Liu et al., 2000; Lopez-Girona et al., 2001; Walker et al., 2009; Zhao and Piwnica-Worms, 2001) La phosphorylation de Chk1 par ATR est conservée entre la levure, le xénope et l’homme (Chen and Sanchez, 2004; Guo et al., 2000; Lopez-Girona et al., 2001). Cependant, le site correspondant à la sérine 317 des mammifères chez la levure (T323) n’est pas nécessaire pour l’activation de Chk1 au niveau du point de contrôle G2-M (Gatei et al., 2003a; Zhao and Piwnica-Worms, 2001). Chk1 peut aussi être phosphorylée dans une moindre mesure par la kinase ATM (Gatei et al., 2003b).

b. Voie de signalisation ATR – Chk1

La cascade de signalisation aboutissant à la phosphorylation de Chk1 a depuis été largement étudiée (Elledge, 1996; O’Connell and Cimprich, 2005; O’Connell et al., 2000; Zhou and Elledge, 2000). Suite à une lésion simple brin de l’ADN, les complexes 9-1-1 (Rad9, Rad1, et Hus1) sont chargés sur ces sites de cassures par RFC (Replication Factor C, ou Rad17). Indépendamment, les protéines RPA viennent se fixer aux extrémités simples brins de part et d’autre de la cassure. Elles servent ensuite de plateforme pour la fixation d’ATRIP, qui permet le recrutement d’ATR. TopBP1 est aussi recruté à ce niveau, où il colocalise avec ATR au niveau de foyers des dommages de l’ADN, et favorise la phosphorylation de nombreux substrats (Chk1, Nbs1, Smc1, H2AX…) dont Chk1 (Figure 9) (Nam and Cortez, 2011; Toledo et al., 2011).

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Figure 9: Activation de Chk1 en réponse à des dommages de l’ADN. L’apparition d’ADN simple brin

entraine le recrutement de RPA, qui se fixe ensuite à ATRIP et permet le recrutement du complexe ATR/ATRIP à la chromatine. Dans le même temps, RFC (Rad17) permet le recrutement du complexe 9- 1-1, qui recrute TopBP1 et permet son rapprochement d’ATR et favorise son activation, ce qui permet l’activation de Chk1 (Toledo et al., 2011).

Trois médiateurs additionnels interviennent dans la signalisation du point de contrôle de phase S : Timeless, son co-facteur Tipin (Timeless-Interacting Protein), et la Claspine (Niida and Nakanishi, 2006). Il a été montré que ce complexe est nécessaire pour la phosphorylation de Chk1 par ATR en réponse aux UV et au traitement par l’hydroxyurée. Le complexe Timeless/Tipin s’associe avec RPA via Tipin, ce qui permet la stabilisation de la Claspine. (Cimprich and Cortez, 2008; Unsal-Kaçmaz et al., 2007; Yoshizawa-Sugata and Masai, 2007). La Claspine demeure répartie dans tout le noyau pendant et après la résolution des dommages de l’ADN, et elle se lie à Chk1 lors de la mise en place du point de contrôle des dommages de l’ADN, via TopBP1 qui permet l’interaction entre ces 2 partenaires (Liu et al., 2006b). Une fois la Claspine et Chk1 associées, la Claspine va servir de protéine adaptatrice pour faciliter la phosphorylation de Chk1 par ATR (Chini and Chen, 2003, 2004).

De nombreuses autres protéines telles que BRCA1, MCPH1 ou p300/CBP semblent importantes pour l’activation maximale de Chk1 par phosphorylation, durant la réponse aux dommages de l’ADN (Draga et al., 2015; Sato et al., 2012; Yarden et al., 2002).

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c. Phosphorylation de Chk1 par ATR et activation en réponse à des dommages de l’ADN

La phosphorylation de Chk1 par ATR est indispensable pour la mise en place des points de contrôle en réponse aux dommages de l’ADN. En effet, lorsque Chk1 est mutée de manière à remplacer la sérine 345 ou la sérine 317 en alanine, et devient de ce fait non phosphorylable, les cellules présentent des défauts au niveau du point de contrôle G2/M, ainsi qu’une sensibilité accrue au stress réplicatif (Capasso et al., 2002).

De manière intéressante, ces 2 sites de phosphorylation par ATR ne jouent pas le même rôle dans l’activation de Chk1 (Niida et al., 2007; Walker et al., 2009; Wilsker et al., 2008). La phosphorylation en sérine 317 favorise la phosphorylation en sérine 345 par ATR et l’initiation de l’activation de Chk1, alors que la phosphorylation en sérine 345 permet la mise en place du point de contrôle. Autrement dit, la mutation sur la sérine 317 n’entraine qu’une diminution de l’activité catalytique de Chk1, contrairement à celle sur la sérine 345 qui provoque une perte totale de son activité catalytique et une diminution de la viabilité cellulaire (Walker et al., 2009; Wilsker et al., 2008).

d. Phosphorylation par ATR et localisation de Chk1

Un autre aspect sur lequel jouent les phosphorylations sur les résidus 317 et 345 est la localisation subcellulaire de Chk1. En effet, une fois activée, Chk1 va être dissociée de la chromatine et va s’accumuler au niveau du nucléole où elle va phosphoryler ses substrats au niveau de la chromatine soluble. Chk1 va aussi être exportée hors du noyau pour interagir avec ses cibles au niveau cytoplasmique (Smits et al., 2006). La mutation sur la serine 345 entraine un défaut d’export de Chk1 dans le cytoplasme, même si la protéine mutée garde la capacité d’être dissociée de la chromatine suite à un stress génotoxique. A l’inverse, la mutation sur la serine 317 bloque la dissociation chromatinienne de Chk1, mais n’empêche pas le Chk1 nucléaire soluble d’être exporté hors du noyau et de se retrouver dans le cytoplasme (Niida et al., 2007).

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Bien que l’activation de Chk1 soit initiée par la phosphorylation d’ATR, le marqueur le plus fiable de l’activité catalytique de Chk1 en réponse à des dommages de l’ADN est son autophosphorylation sur le résidu sérine 296 (Goto et al., 2015).