Statut actuel de du manuscrit 3.1
J. Pharmacol Toxicol Methods 53, 106-116 (2006).
46. Caru, B., Colombo, E., Santoro, F., Laporta, A. & Maslowsky, F. Regional flow responses to exercise. Chest 101, 223s-225s (1992).
164
Figure 1. Conditions de linéarité en fonction de la quantité de protéine et du temps d’incubation dans l’échantillon #21 de microsomes de cœur humain avec le cocktail 1 (Ébastine, chlorzoxazone, bupropion et midazolam)
1A. 1B.
Figure 1A et 1B. Conditions de linéarité du substrat ébastine dans l’échantillon microsomal de cœur humain (MCH#21) 1A. Conditions de linéarité en fonction de la quantité de protéines de MCH
(incubation de 60 minutes). 1B. Conditions de linéarité en fonction du temps dřincubation (quantité de protéines : 0.7635 mg). Les incubations ont été effectuées à 15 µM dřébastine dans un tampon 100 mM PO4. La formation dřhydroxyébastine est linéaire pour un intervalle de 0.2545 à 0.7635 mg de protéines de
MCH (r2 0.99) et pour un intervalle de 0 à 60 minutes (r2 0.99).
1C. 1D.
Figure 1C et 1D. Conditions de linéarité du substrat chlorzoxazone dans l’échantillon microsomal de cœur humain (MCH#21) 1C. Conditions de linéarité en fonction de la quantité de protéines de MCH
(incubation de 60 minutes). 1D. Conditions de linéarité en fonction du temps dřincubation (quantité de protéines : 0.7635 mg). Les incubations ont été effectuées à 378 µM de chlorzoxazone dans un tampon 100 mM PO4. La formation dřhydroxychlorzoxazone est linéaire pour un intervalle de 0.2545 à 0.7635 mg
165
1E. 1F.
Figure 1E et 1F. Conditions de linéarité du substrat bupropion dans un échantillon microsomal de cœur humain (MCH) 1E. Conditions de linéarité en fonction de la quantité de protéines de MCH
(incubation de 60 minutes). 1F. Conditions de linéarité en fonction du temps dřincubation (quantité de protéines : 0.7635 mg). Les incubations ont été effectuées à 465 µM de bupropion dans un tampon 100 mM PO4. Une régression linéaire a été calculée pour un intervalle de 0.2545 à 0.509 mg de protéines de
MCH (r2 0.99) et pour un intervalle de 0 à 60 minutes (r2 0.95).
1G. 1H.
Figure 1G et 1H. Conditions de linéarité du substrat midazolam dans l’échantillon microsomal de cœur humain (MCH#21) 1E. Conditions de linéarité en fonction de la quantité de protéines de MCH
(incubation de 60 minutes). 1F. Conditions de linéarité en fonction du temps dřincubation (quantité de protéines : 0.7635 mg). Les incubations ont été effectuées à 3 µM de midazolam dans un tampon 100 mM PO4. Une régression linéaire a été calculée pour un intervalle de 0.2545 à 0.7635 mg de protéines de MCH
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Figure 2A. Cinétique moyenne dřhydroxylation de lřébastine (0,075 à 2,5 µM) dans les
microsomes de 18 cœurs humains ventriculaires (#1 à 18). (Chaque point est une moyenne ± SEM de 18 échantillons de cœurs où chaque concentration est initialement une moyenne de triplicata ± SD par échantillon).
Figure 2B. Représentation graphique selon le modèle Eadie-Hosftee des données des
échantillons #1 à 18. La valeur de vélocité associée à la concentration dřébastine de 1, 1,5 et 2,5 µM ont été retirées afin dřobtenir un profil de composante cinétique sans la participation de point où lřactivité est inhibée par le substrat. (V = vélocité : pmoles dřhydroxyébastine / min / mg de protéines, S = concentration de substrat ébastine : µM)
167
Figure 3A.Cinétique moyenne dřhydroxylation de la chlorzoxazone (30 à 1000 µM)
dans les microsomes de 14 ventricules de cœurs humains (#1, 4 à15 et 18). (Chaque point est une moyenne ± SEM de 14 échantillons de cœurs où chaque concentration est initialement une moyenne de triplicata ± SD par échantillon)
Figure 3B. Représentation graphique selon le modèle Eadie-Hosftee des données des
échantillons #1 à 15 et 18. (V = vélocité : pmoles dřhydroxychlorzoxazone / min / mg de protéines, S = concentration de substrat chlorzoxazone : µM)
168
Figures 4. Essais d’inhibition de l’hydroxylation du substrat ébastine dans les rhCYP2J2, HLM et MCH
Figure 4A. Pourcentage dřactivité restante suivant des incubations avec lřébastine dans les rhCYP2J2, les HLM et les MCH avec des inhibiteurs chimiques. Chaque colonne est présentée sous forme de pourcentage dřune moyenne de triplicata ± écart-type. Statistiques; test de t par rapport au contrôle sans inhibiteur (100%); légende *p<0,05.
Figure 4B. Inhibition de lřhydroxylation de lřébastine lors du chauffage des isoenzymes recombinants rhCYP2J2, les HLM et les MCH à 60°C 10 minutes avant la pré- incubation. Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart-type. Statistique ; test de t par rapport au contrôle à 37 °C (100%); légende *p<0,05.
169
Figure 4C. Inhibition de lřhydroxylation de lřébastine avec lřanticorps anti-CYP2J2 humain (gracieuseté du Dr. Darryl C. Zeldin, M.D., NIH) incubé 10 minutes avec les isoenzymes recombinants rhCYP2J2 et les MCH avant la pré-incubation. Aucune statistique nřa été effectuée car lřincubation avec anticorps est une donnée unique. Insertion : Pourcentage dřactivité de formation de carébastine par rapport au contrôle sans anticorps anti-CYP2J2 suite à des incubations dřébastine.
170
Figure 4D. Courbe dřinhibition de lřhydroxylation de lřébastine dans les MCH avec différentes concentration dřastémizole (1 à 150 µM) incubée en même temps que lřébastine et les MCH lors de la pré-incubation. (Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart-type)
Figure 4E. Courbe dřinhibition de lřhydroxylation de lřébastine dans les MCH avec différentes concentration de terfénadine (1 à 100 µM) incubée en même temps que lřébastine et les MCH lors de la pré-incubation. (Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart-type)
171
Figures 5. Essais dřinhibition de lřhydroxylation du substrat chlorzoxazone dans les rhCYP2J2, HLM et MCH.
Figure 5A. Pourcentage dřactivité restante suivant des incubations avec la chlorzoxazone dans les rhCYP2E1, les HLM et les MCH avec des inhibiteurs chimiques. Chaque colonne est présentée sous forme de pourcentage dřune moyenne de triplicata ± écart- type. Statistiques; test de t par rapport au contrôle sans inhibiteur (100%); légende *p<0,05.
Figure 5B. Essaie dřinhibition avec la chlorzoxazone incubée avec les MCH soumis à des températures de 60°C et 90°C 10 minutes avant lřincubation. Chaque donnée est un
172
triplicata présenté par une moyenne ± écart-type. Statistique ; test de t par rapport au contrôle à 37 °C (100%); légende *p<0,05.
Figure 5C. Inhibition de lřhydroxylation de la chlorzoxazone avec lřanticorps anti- CYP2E1 humain (MAB-rhCYP2E1, BD Gentest) incubé 10 minutes avec les MCH de 5 échantillons différents avant la pré-incubation. Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart-type. Statistique ; test de t par rapport au contrôle (100%); légende *p<0,05.
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Figure 5D. Inhibition de lřhydroxylation de la chlorzoxazone avec lřanticorps anti- CYP1A1 humain (MAB-rhCYP1A1, BD Gentest) incubé 10 minutes avec les MCH dřun échantillon avant la pré-incubation. Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart-type. Statistique ; test de t par rapport au contrôle (100%); légende *p<0,05.
Figure 5E. Inhibition de lřhydroxylation de la chlorzoxazone avec lřanticorps anti- CYP1A2 humain (MAB-rhCYP1A2, BD Gentest) incubé 10 minutes avec les MCH dřun échantillon avant la pré-incubation. Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart-type. Statistique ; test de t par rapport au contrôle (100%); légende *p<0,05.
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Figure 5F. Inhibition de lřhydroxylation de la chlorzoxazone avec un inhibiteur non sélectif des CYP450 incubé 10 minutes avec les MCH de 6 échantillons différents avant la pré-incubation. Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart- type. Statistique ; test de t par rapport au contrôle (100%); légende *p<0,05.
Figure 5G. Inhibition de lřhydroxylation de la chlorzoxazone par le solvant DMSO (total de 1% de solvant dans lřincubation : 0,5 % MeOH + 0,5 % DMSO) incubé 10 minutes avec les microsomes dřun échantillon de cœur humain. Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart-type. Statistique ; test de t par rapport au contrôle
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Figure 5H. Inhibition de lřhydroxylation de la chlorzoxazone avec lřinhibiteur non sélectif des CYP450 SKF525 incubé 10 minutes avec les MCH dřun échantillon avant la pré-incubation. Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart-type. Statistique ; test de t par rapport au contrôle (100%); légende *p<0,05.
Figure 5I. Inhibition de lřhydroxylation de la chlorzoxazone avec lřinhibiteur sélectif de lřisoenzyme CYP2E1 incubé 10 minutes avec les MCH de 8 échantillons différents avant la pré-incubation. Chaque donnée est un triplicata présenté par une moyenne ± écart-type. Statistique ; test de t par rapport au contrôle (100%); légende *p<0,05.
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Table 1. Paramètres de cinétiques enzymatiques d'hydroxylation de l'ébastine dans les MCH # d'échantillon
de MCH
Modèle dřajustement des courbes utilisées Vmax (pmoles OHEBA/min/mg de protéines) Km (µM) CLint calculée (µl/min/mg de protéines) CLint extrapolée Modèle Eadie- Hofstee) 1 Substrate inhibition 0,4 0,10 4 5, 2 Substrate inhibition 3,3 0,36 10 10 3 Substrate inhibition 6,1 0,39 16 16 4 Substrate inhibition 1,2 0,09 14 18 5 Substrate inhibition 9,4 0,30 32 33 6 Substrate inhibition 2 0,23 9 10 7 Michaelis-Menten 0,6 0,08 7 9 8 Substrate inhibition 2,2 0,16 14 17 9 Substrate inhibition 1 0,11 9 10 10 Michaelis-Menten 2,1 0,11 20 19 11 Substrate inhibition 4 0,11 38 40 12 Substrate inhibition 9 0,33 28 42 13 Michaelis-Menten 0,9 0,68 1 7 14 Substrate inhibition 0,7 0,12 6 20 15 Substrate inhibition 3 0,17 18 7 16 Substrate inhibition 0,9 0,15 9 28 17 Substrate inhibition 4,2 0,18 24 12 18 Substrate inhibition 1,8 0,19 10 n.c Moyenne 2,9 0,21 15 18 É.T. 2,7 0,15 10 12 CV % 94 71 69 65
Légende : CV : coefficient de variation é.t. : écart-type, Km; constante dřaffinité, n.c. : non calculée, nl : nanolitre, µM : micromolaire, Vmax : vélocité
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Table 2. Paramètres de cinétiques enzymatiques d'hydroxylation de la chlorzoxazone dans les MCH
Légende : CV : coefficient de variation é.t. : écart-type, Km; constante dřaffinité, n.c. : non calculée, nl : nanolitre, µM : micromolaire, Vmax : vélocité
maximale. *les échantillons #16 et 17 nřont pu être calculés car un nombre de points insuffisants étaient disponibles pour lřestimation. La majorité des concentrations de chlorzoxazone incubées ont donné un signal non détectable de formation dřhydroxychlorzoxazone.
Modèle Michaelis Menten Modèle Eadie-Hofstee
Composante enzymatique Composante enzymatique 1 Composante enzymatique 2
# d'échantillon de MCH Vmax (pmoles OHCZX/min/ mg de protéines) Km (µM) CLint (nl/min/ mg de protéines) Vmax (pmoles OHCZX/min/ mg de protéines) Km (µM) CLint (nl/min/ mg de protéines) Vmax (pmoles OHCZX/min/ mg de protéines) Km (µM) CLint (nl/min/ mg de protéines) 1 30,6 3472 9,7 1,9 91,4 22,9 25,9 2860 9,9 2 n.c. n.c. n.c. 3,3 145,2 24,6 97,7 7056 15,1 3 n.c. n.c. n.c. 2,1 143,1 16,0 85,4 11840 7,9 4 74,9 9192 8,9 2,4 159,1 16,2 37,4 4310 9,5 5 14,3 1062 14,8 14,2 1048,0 14,8 n.c. n.c. n.c. 6 195,7 13863 15,4 3,2 60,7 57,0 30,5 1701 19,6 7 9,5 864 12,1 8,9 775,5 12,6 n.c. n.c. n.c. 8 14,1 1995 7,7 3,4 400,2 9,4 12,6 1676 8,2 9 11,1 1156 10,5 2,8 148,4 20,6 13,8 1647 9,2 10 13,4 3654 4,0 1,1 102,0 11,4 29,1 8967 3,6 11 8,6 1872 5,0 1,1 89,7 13,5 7,5 1564 5,2 12 11,2 1134 10,8 1,9 57,7 37,0 17,8 2275 8,5 13 177,5 10469 18,6 31,1 1717,0 19,8 44,2 2287 21,2 14 52,2 4233 13,5 2,4 42,1 62,9 38,3 3078 13,6 15 61,9 1956 34,6 12,3 255,4 52,5 61,0 1948 34,3 16* n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. 17* n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. n.c. 18 57,9 2283 27,8 10,9 401,6 29,7 36,6 1270 31,6 Moyenne 52,4 4086 13,8 6,4 352,3 26,3 38,4 3749 14,1 É.T. 61,3 4084 8,4 7,8 459,9 17,1 26,6 3241 9,4 CV % 117 100 61 122 131 65 69 86 67