Les PHAmcl

Le métabolisme de synthèse des PHAmcl est totalement différent de celui des PHAscl. En effet, il ne constitue pas une voie métabolique, il est plutôt une déviation des voies métaboliques impliquant les acides gras. Selon le substrat présent dans le milieu de culture, le métabolisme anabolique ou catabolique des acides gras est activé et la synthèse des PHAmcl utilise les intermédiaires métaboliques de ces deux voies. Les deux voies métaboliques responsables de la synthèse des précurseurs des PHAmcl sont:

 la dégradation des acides gras par -oxydation, qui est la voie principale quand les acides gras sont utilisés comme substrats,

 la biosynthèse de novo des acides gras qui est la voie principale lors de la croissance bactérienne sur des sucres (Witholt 1999).

Le métabolisme de synthèse { partir d’acides gras est directement associé au métabolisme catabolique des acides gras (-oxydation) (Lageveen 1988). L’entrée dans le cycle se fait par activation d’un alcanoate par fixation du coenzyme A (HS-CoA) (Figure 6) pour conduire à un dérivé acyl-CoA. Au cours de ce chaînon oxydatif, les acides gras sont progressivement dégradés par une série de quatre réactions décrivant un processus en boucle (rectangle bleu, Figure 6). Après un cycle, deux atomes de carbone sont éliminés sous forme d’acétyl-CoA.

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Figure 6: Détails des voies métaboliques de biosynthèse des PHAmcl. (CoA = coenzyme A,

ACP = acyl carrier protein).

Le résidu acyl-CoA (avec deux carbones en moins) recommence alors un cycle. A partir de cette voie métabolique se greffe la synthèse des PHAs (rectangle vert, Figure 6). La PHA polymérase utilise comme co-substrat les (R)-3-hydroxyalcanoyl-CoA dont la longueur est comprise entre 6 et 14 atomes de carbone. Comme les intermédiaires du cycle de la  -oxydation sont de configuration S et que la PHA polymérase ne reconnaît que les substrats de configuration R, cela implique une étape enzymatique supplémentaire faisant intervenir une épimérase (Gross 1989).

Lorsque l’acide gras (source de carbone) comporte 6 { 12 atomes de carbone, les PHAs formés comportent, dans la plupart des cas, des unités de répétition avec un nombre d’atomes de carbone égal { celui de la source de carbone ou avec deux atomes de carbone en moins. Par exemple, la culture de Pseudomonas sp. GP01 en présence d’octanoate de

37 sodium ou d’octane comme seule source de carbone (Desmet 1983; Preusting 1990), conduit

{ la synthèse d’un copolymère statistique, le poly(3-hydroxyoctanoate-co

-3-hydroxyhexanoate) PHOHHx, possédant comme unité majoritaire le 3-hydroxyoctanoate (Ballistreri 1990; Gagnon 1992).

L’utilisation de mélanges d’acides gras, d’alcanes et d’alcènes comme source de carbone pour la bactérie se traduit par la formation de PHAs dont la composition est le plus souvent le reflet du ratio de chacun des composants du milieu de culture (Tableau 1). L’utilisation de n-alcane ou de n-alcène comme substrat est possible si la bactérie possède les gènes permettant l’oxydation des alcanes ou alcènes en acides (Figure 6) (Witholt 1990).

Si la bactérie est cultivée avec un mélange d’octane et d’octène, le ratio de monomères présentant une insaturation est fonction de la quantité initiale d’octène. La fraction molaire en unités insaturées peut atteindre 50% lorsque le mélange initial est constitué exclusivement d’octène. De même, l’introduction dans le milieu de culture de différents alcanoates substitués en tant que co-substrat (7-méthyloctanoate, 8-bromooctanoate, phénylundécènoate, cyanophénoxyhexanoate) permet de synthétiser des polymères originaux du point de vue de leur composition (Fritzsche 1990b; Haywood 1990; Kim 1991; Kim 1995). Cette facilité à incorporer directement des monomères exotiques explique en partie la diversité des copolymères de PHAs générés par les bactéries.

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Tableau 1: Composition des PHAmcl accumulés par Pseudomonas sp. GP01 à partir de

différents alcanes et alcanoates (Anderson 1990). Source de

carbone

PHA (% g/g)

Unités 3-hydroxyacides incorporées dans les PHAs (mol %) C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 Alcane Hexane 2 - - 100 - - - - - - Heptane 11,4 - - - 100 - - - - - Octane 25,3 - - 11 - 89 - - - - Nonane 24,3 - - - 37 - 63 - - - Decane 21,9 - - 10 - 66 - 24 - - Undecane 14,3 - - - 23 - 63 - 14 - Dodecane 5,8 - - 2 - 31 - 36 - 31 Alcanoate Hexanoate 5 3 <1 72 - 22 - 3 - - Heptanoate 22 - 7 <1 86 <1 7 - - - Octanoate 41 <1 1 6 - 75 - 17 - - Nonanoate 49 - 3 <1 20 5 72 - - - Decanoate 37 <1 1 7 - 44 - 47 - -

Lorsque la source de carbone est composée de sucres, le PHA accumulé dans les bactéries est composé majoritairement de monomères constitués de 8 à 10 atomes de carbone (Timm 1990; Eggink 1992; Huijberts 1992). Ces monomères dérivent de la biosynthèse des acides gras (Rectangle rouge, Figure 6). Les différentes étapes de la biosynthèse des acides gras se déroulent grâce à un complexe multi-enzymatique de grande taille: l’ACP (Acyl-Carrier-Protein). A l’issue de cette suite de réactions, le dérivé (R)-3-hydroxyacyl-CoA constitue le substrat de la PHA polymérase. La composition du PHA accumulé reflète la composition chimique des intermédiaires métaboliques de la biosynthèse des acides gras ainsi que l’affinité de la PHA polymérase pour ces différents substrats.

De nombreuses espèces de Pseudomonas utilisent les deux voies métaboliques, c’est le cas de Pseudomonas putida pour laquelle le cycle de la -oxydation et la synthèse de novo

des acides gras contribuent à la formation des substrats de la PHA polymérase (Haywood 1989; Huijberts 1994).

39 Les voies de synthèse présentées ici ne sont pas les seules voies existantes. De nombreux travaux ont été réalisés pour élucider les voies de synthèse chez d’autres bactéries sauvages ou mutantes (Haywood 1991; Steinbuchel 1992).

Les méthodes de détection de microorganismes capables de synthétiser et d’accumuler du PHA basées sur des colorations des lipides au Noir Soudan ou Bleu de Nil peuvent réagir avec d’autres inclusions lipidiques et ne sont donc pas spécifiques. De plus, le microorganisme doit être dans les conditions lui permettant d’accumuler le PHA. Une stratégie basée sur la détection d’une séquence homologue des gènes de PHA synthase semble plus efficace. La PHAmcl synthase est codée par deux gènes phaC1 et phaC2 séparés par le gène codant pour la PHA dépolymérase phaZ formant l’opéron phaC1ZC2 (Figure 7) (Huisman 1991). L’opéron phaC1ZC2 est bien caractérisé et, par alignement, il a été mis en évidence que les séquences d’ADN des gènes phaC1, phaZ et phaC2 de nombreuses espèces de

Pseudomonas sont homologues (Solaiman 2000). Une méthode a ainsi été mise au point en utilisant des amorces spécifiques aux gènes phaC1 et phaC2 (Ciesielski 2006). Le schéma de l’opéron phaC1ZC2 de la figure 7 montre que l’utilisation des amorces I-179L et I-179R permet d’amplifier par PCR (Polymerase Chain Reaction, réaction en chaîne par polymérase) une séquence homologue aux gènes phaC1 et phaC2. Le fragment d’ADN amplifié, délimité par les amorces choisies, fait environ 540 paires de bases. Cette méthode est simple à mettre en œuvre et permet de déterminer rapidement la capacité d’une souche { produire ou non des PHAmcl.

Figure 7: Schéma de l’opéron phaC1ZC2 montrant la position des amorces I-179L et I-179R.

phaC1 et phaC2 sont les gènes codant la PHA synthase, phaZ la PHA dépolymérase et phaD

40 Si la biosynthèse des PHAmcl commence à être bien comprise, le phénomène de régulation l’est moins (Luengo 2003). L’identification de la dépolymérase intracellulaire codée par le gène phaZ est récente (de Eugenio 2007) et le rôle des phasines et des autres protéines présentes { la surface des granules n’est pas encore totalement élucidé.