Perspectives et suite donnée pour l’accès à des mimes d’hélices PPII

La 4-oxaproline (4-Opr), facilement accessible contrairement à la 5-Opr qui nécessite un mois de synthèse, nous est apparu intéressant comme modèle chimique de réactivité. Ainsi, nous nous sommes intéressés à la 4-Opr qui possède un carbone entre l’azote et l’oxygène, afin d’avoir un point de comparaison avec la 5-Opr au niveau réactivité mais également au niveau structural et activité biologique. D’après nos recherches bibliographiques, ce motif a été très étudié par le groupe de Mutter, son insertion dans des séquences peptidiques a par exemple permis de moduler les propriétés physico-chimiques et la conformation des pseudo-peptides.365,366 Le dérivé 421 comportant un groupement trifluoromethyle en position 2 a également fait l’objet d’une étude sur son insertion dans un tripeptide en stratégie Fmoc en solution (Schéma 6). 367

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Schéma 6. Insertion dans un tripeptide de la 2-(CF3)-4-oxaproline

En nous inspirant d’un protocole décrit dans la littérature pour l’accès au cycle 4-Opr, le composé M17 a été obtenue one pot à partir de la (L)-Sérine en présence de formaldéhyde et de soude.368

La dernière étape étant la protection de l’amine, nous avons opté pour une protection Fmoc afin de privilégier son insertion dans un peptide par SPPS (Schéma 7).

Schéma 7. Synthèse de la Fmoc-(4-Opr)-OH

Nous pouvons déjà constater que l’accès à la 4-Opr est beaucoup plus simple et rapide que pour la 5-Opr. D’autre part, en appliquant une SPPS sur résine de type Rink amide-PS en présence de HATU et de DIEA, les trois peptidomimétiques cibles de HSKYPLPPLPSL ont été obtenus sans difficulté et avec de bons rendements globaux (11-18%). Nous avons ainsi prouvé que notre

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stratégie de synthèse était adaptée et que les problèmes rencontrés précédemment sont vraiment reliés à la structure particulière de la 5-Opr. Les peptides contenant la 4-Opr ont tout de même montré une certaine instabilité en milieu acide, notamment lors d’un clivage de la résine trop prolongé (3h), l’ouverture de la 4-Opr avec perte d’un groupement méthylène a été remarquée (Schéma 8).

Schéma 8. Ouverture d’une 4-Opr en milieu acide

Toutefois, en réalisant un clivage contrôlé de la résine (2 x 30 min), les trois peptidomimes ont été préparés avec de bons rendements globaux puis évalués par nos collaborateurs du CRCM pour des tests d’inhibition protéine-protéine par la technique HTRF pour « Homogenous time-resikved fluorescence assay » (Tableau 4).369

Ce test, basé sur le système FRET (Fluorescence Resonance Energy transfer), produit un phénomène de fluorescence lorsque deux fluorophores sont suffisament proches pour permettre un transfert d’énergie. En effet, en utilisant un fluorophore donneur dont la longueur d’onde d’émission correspond à la longueur d’onde d’excitation d’un fluorophore accepteur, une zone de longueur d’onde commune (en gris sur la Figure 62) permet de réaliser un transfert d’énergie.

Figure 62. Principe du FRET

Dans le cadre de l’HTRF, les fluorophores donneurs utilisés sont les cryptates d’Europium développés par le Pr J.M. Lehn (Figure 63) ou les crytpates de Terbium qui possèdent chacun une émission de longue durée (1-2 ms). Les fluorophores accepteurs sont quant à eux soit XL665 (édifice hétéro-hexamérique de 105 kDa) soit d2 (composé de 1 kDa), les deux possédant des caractéristiques spectrales similaires.

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Figure 63. Structure du Cryptate d’Europium

Grâce à cette technique, lorsque deux protéines intéragissent entre elles, les deux fluorophores sont proches pour permettre un transfert d’énergie. En revanche, lorsqu’un inhibiteur d’interactions protéine-protéine est présent, les deux fluorophores vont s’éloigner empêchant ainsi le transfert d’énergie et modifiant par conséquent la fluorescence émise observée.

Dans le cadre de cette étude, d’une part la protéine de fusion GST-Hck issue des domaines SH3 (B, en gris foncé, Figure 64) est couplée à un anticorps anti GST (Y, en violet, Figure 64) lui-même couplé au donneur Cryptate de Terbium. D’autre part, le ligand de GST-Hck (HSKYPLPPLP), chimiquement marqué à la biotine (A, en orange, Figure 64), est lié de manière non covalente à la streptavidine elle-même marquée par le fluorophore accepteur d2 (X, en bleu, Figure 64). En effet, la streptavidine est une protéine présentant une très forte affinité pour la biotine avec un KD de l’ordre de 10-14 M. De part l’interaction protéine-protéine entre GST-Hck et son ligand, le donneur et l’accepteur vont se rapprocher entraînant un transfert d’énergie et une émission de fluorescence. En revanche, lors de l’ajout d’un inhibiteur plus ou moins affin pour la protéine GST-Hck (en vert, Figure 64), dans notre cas les peptidomimes comportant un ou plusieurs motifs 4-Opr, une diminution voir une disparition de la fluorescence est souhaitée.

Figure 64. Représentation shématique de test de compétition

A : Ligand chimiquement marqué par la biotine ; X = Streptavidine ; B = protéine de fusion GST-HCK (SH3) ; Y = anticorps anti GST

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Le marquage du ligand initial HSKYPLPPLPSL par la biotine a été réalisé par l’utilisation de la lysine biotinylée ainsi que d’un brin espaceur composé de six acides aminés permettant d’augmenter la pénétration cellulaire (Figure 65).

Figure 65. Structure du peptide de référence marqué par la biotine

L’application de ce test de compétition à nos peptidomimes a révélé que l’insertion de 4-Opr dans le peptide est destructurante diminuant l’affinité du peptidomime pour la protéine GST-Hck de manière proportionnelle au nombre de 4-Opr présentes (Tableau 4).

PEPTIDES IC50 Rdt (%)

HSKY(4-Opr)L(4-Opr)(4-Opr)L(4-Opr)SL 255µM 11 HSKYPLP(4-Opr)L(4-Opr)SL 71 µM 15

HSKYPLP(4-Opr)LPSL 17 µM 18

HSKYPLPPLPSL 1 µM 22

Tableau 4. Evaluations biologiques des peptides comportant le motif 4-oxaproline

Pour conclure, les difficultés de synthèse rencontrées lors de l’oligomérisation du motif 5-Opr ou de son insertion dans de longues séquences peptidiques n’ont pas permis d’accéder à des inhibiteurs d’interactions protéine-protéine intéressants ni à des mimes d’hélices PPII. Toutefois, la mise en place d’une synthèse efficace du tripeptide H-(5-Opr)3-OEt M12 laisse entrevoir des perspectives pour une étude en tant que mimes de triprolines.

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