Perspectives futures pour ce projet

La caractérisation des membres de la classe des FRKs n’en est qu’à ses premiers balbutiements, puisque seulement trois des six FRKs présents chez Solanum chacoense ont été caractérisés jusqu’à maintenant et aucun autre membre n’a été étudié chez une autre espèce, mis à part Arabidopsis thaliana (AtMAPKKK19-21) et Brassica napus (BnMAPKKK19-21). En continuité avec le projet, il serait donc intéressant d’approfondir nos connaissances de cette classe en examinant les rôles des autres FRKs chez Solanum chacoense (ScFRK4-6), par exemple en comparant leurs patrons d’expression avec ceux obtenus chez ScFRK1-3. Des mutants dont l’expression des trois différents gènes est perturbée pourraient être analysés, puis, encore une fois, comparés aux phénotypes obtenus avec les mutants déjà étudiés. De plus, l’hypothèse d’un rôle plus spécifique des FRKs aux Solanacées ayant été émise, il serait donc essentiel d’examiner leurs rôles chez d’autres espèces, autant des Solanacées (Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum, Nicotiana benthamiana, par exemple) que chez des espèces provenant d’autres familles (Populus trichocarpa, Vitis vinifera), ainsi que chez Amborella trichopoda, l’angiosperme basal connu pour ne posséder qu’une seule FRK (la FRK primitive). Des patrons d’expression peuvent être analysés et, dans certains cas, il pourrait même être possible de créer des mutants. Puisque de plus en plus de génomes et de transcriptomes sont

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désormais disponibles, il serait intéressant de refaire l’analyse phylogénétique avec un plus grand nombre d’espèces. Cela faciliterait et apporterait des précisions importantes sur l’évolution de la classe des FRKs (confirmation de son origine chez les angiospermes ainsi que de sa perte chez les monocotylédones) ainsi que sur la sous-famille des MEKKs.

Le travail à propos de la caractérisation de ScFRK3 pourrait aussi être plus approfondi. Des double-hybrides et des BiFC ont confirmé l’interaction entre ScFRK3 et ScMKK3, mais afin de prouver leur interaction dans le cadre d’une cascade de signalisation par voie MAPK, il faudrait aussi prouver le transfert d’un groupement phosphate de la MEKK vers la MKK. Pour ce faire, un essai kinase in vitro en utilisant des versions purifiées des protéines ScFRK3 et ScMKK3, à l’aide de [γ-32_{P] dATP, pourrait constituer une excellente expérience. D’ailleurs,} les trois protéines formant la voie potentielle, ScFRK3, ScMKK3 et ScMPK4, ainsi que chacune de leur version kinase-dead, dont le domaine kinase a été modifié pour rendre la protéine inactive, ont été clonées dans des vecteurs pour expression bactérienne (His-tag), puis elles ont été purifiées sur colonne. ScMKK3 et ScMPK4 ont été exprimées et purifiées avec succès, mais bien que ScFRK3 était suffisamment exprimée, nous n’avons pas été en mesure de purifier la protéine. En effet, cette dernière n’étant soluble qu’en conditions dénaturantes (8M urée), il a été impossible de réduire la concentration d’urée sans qu’elle forme un précipité, malgré plusieurs tentatives (différentes conditions utilisées pour effectuer la dialyse, par exemple). Une solution envisageable pour tenter de résoudre le problème serait d’utiliser une autre étiquette pour purifier ScFRK3, GST, par exemple (GST-tag ou His-GST-tag). La GST étant une plus grosse étiquette comparée à His, les chances de bons repliements de la protéine exprimée sont plus grandes, ce qui éviterait la précipitation de cette dernière.

Si la voie de signalisation proposée dans cette thèse (ScFRK3 → ScMKK3 → ScMPK4) s’avère confirmée par les essais kinases, il deviendrait alors intéressant d’investiguer plus en profondeur sur les causes de cette voie (en amont) et ses conséquences (en aval). Par exemple, afin de découvrir les facteurs de transcription, ou tout autre protéine située en aval de la voie, un criblage en double-hybride chez la levure pourrait être envisagé en utilisant ScMPK4 comme appât. Une autre façon de faire pourrait être d’incuber ScMPK4 activée avec de l’ATP et un extrait de protéines provenant d’ovaires et d’étamines, puis de faire séquencer la fraction enrichie en protéines phosphorylées. En comparant avec le contrôle négatif, par exemple un

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extrait incubé avec une version kinase-dead de ScMPK4, il serait simple de cibler les protéines qui agissent possiblement en aval de la voie. Pour ce qui est de découvrir ce qui se passe en amont de la voie, cela restera plus difficile. En effet, partir à la recherche des récepteurs ou des ligands peut s’avérer une tâche particulièrement ardue. Il est possible de trouver des récepteurs en optant pour un criblage en double-hybride en utilisant ScFRK3 comma appât, par exemple, mais puisque selon notre hypothèse de voie de signalisation classique, le récepteur serait transmembranaire, il y a des possibilités de ne pas le retrouver dans les candidats positifs du criblage. De plus, en ce moment, rien ne nous confirme la présence de cette voie de signalisation classique ; ScFRK3 pourrait être activée par autre chose qu’un récepteur transmembranaire de type kinase. Un autre fait à considérer est qu’il est impossible de produire des mutants pour en faire le criblage, Solanum chacoense étant une espèce d’une assez grande taille au développement plutôt lent comparé à Arabidopsis thaliana, il est donc impensable d’opter pour cette option.

5. Conclusion

Ce projet, qui avait pour but ultime de permettre l’avancée des connaissances dans le domaine de la biologie moléculaire de la reproduction végétale a atteint l’ensemble des objectifs énumérés dans cette thèse. En plus de l’amélioration de notre compréhension globale sur le sujet, ce projet a permis à d’autres hypothèses encore plus larges de prendre forme, notamment au niveau de la fonction de certains gènes apparus au cours de l’évolution des plantes à fleurs. En somme, cela me permet de qualifier ce projet de réussite.

La science étant un mouvement continu, je souhaite et j’espère que ce projet ouvrira le chemin vers de nombreux autres projets. Comme mentionné dans cet ouvrage, le développement des gamétophytes, principalement le sac embryonnaire, demeure un mystère malgré les nombreux mutants qui ont été caractérisés au fil des années. Arriverons-nous un jour à percer le mystère ? J’en doute, mais qui suis-je pour savoir ce qui se passera au cours des prochaines décennies…