Chapitre III : le système nociceptinergique
4. Distribution du système nociceptinergique
3.2. Peptides issus du séquençage de novo
La découverte de nouveaux neuropeptides potentiels au sein de précurseurs connus, nous a
poussés à nous interroger sur la présence éventuelle de peptides totalement inconnus dans le
cervelet en développement. Pour essayer de répondre à cette question, nous avons utilisé une
approche par séquençage de novo afin d’identifier tous les peptides présents dans nos
échantillons. Parmi les 19 000 séquences n’appartenant pas à des protéines connues chez le rat,
seules 17 sont retrouvées de façon récurrente au sein des échantillons. Même lorsque le seuil
de récurrence est abaissé à 5 fois sur 10 (au lieu de 7 fois sur 10), le nombre de séquences ne
dépasse pas 60. Ce faible nombre implique que la quasi-totalité des séquences ne sont pas
répétées, et pourraient donc provenir de produits de dégradation aléatoire de protéines.
Cependant, nous avons observé que certaines séquences sont présentes sous plusieurs formes.
Cette variabilité est communément rencontrée lors de séquençage de novo et est due à l’erreur
expérimentale de masse qui entraîne parfois l’inversion de 2 acides aminés en début ou fin de
séquence, là où le séquençage par MS/MS est le moins précis (Muth and Renard 2017). Il peut
également s’agir d’un acide aminé modifié dont la masse est très proche d’un autre acide aminé.
Ce cas a été observé pour l’une des 17 séquences retrouvées de façon récurrente où l’asparagine
acétylée possède une masse très proche de celle du couple glycine-valine. Ces erreurs de
séquençage nécessitent une vérification manuelle très longue mais dans le cadre d’une analyse
informatique automatisée augmentent de façon erronée la diversité des séquences et diminuent
donc en conséquence le nombre de séquences récurrentes. A ce stade de notre analyse, les
séquences qui apparaissent régulées au cours du développement ont été identifiées comme des
139
fragments de protéines chez différentes espèces, il s’agit maintenant de savoir si ce sont
simplement des produits de dégradation de protéines, ou si certaines pourraient finalement
correspondre à des peptides bioactifs. Pour essayer de répondre à cette question il est possible
de s’intéresser à la régulation de ces protéines et à leur rôle éventuel au cours du développement.
La zinc finger protein 804A dont est issue la séquence LEDLKTE est fortement exprimée au
moment de la naissance dans l’hippocampe, en particulier au niveau des cônes de croissance
des neurites (Hinna et al. 2015). De plus, cette protéine favorise l’expression de gènes impliqués
dans l’adhésion cellulaire ce qui suggère qu’elle pourrait promouvoir la différenciation, la
synaptogenèse et/ou la migration neuronale (Hill et al. 2012). Les protéines dont sont issues les
5 autres séquences ne semblent pas impliquées dans le développement. Afin de déterminer si
ces séquences pourraient correspondre à des peptides bioactifs, plusieurs stratégies sont
possibles comme l’alignement évolutif ou la recherche de caractéristiques de séquences.
L’alignement évolutif peut se faire à partir de la séquence peptidique ou génomique afin
d’identifier les régions les plus conservées au cours de l’évolution qui sont les plus susceptibles
d’exercer une fonction biologique. Cette méthode a été utilisée pour réaliser le peptidome d’une
espèce de termite et a permis d’identifier 163 peptides prédits dont la séquence est très proche
de peptides connus chez d’autres espèces d’arthropodes (Christie 2015). Certaines catégories
de peptides présentent des caractéristiques précises au niveau de leur hydrophobicité, de leur
charge et de leur conformation. C’est le cas des peptides antimicrobiens qui peuvent donc être
recherchés sur la base de ces critères. Pour cela, des équipes utilisent des outils bioinformatiques
puissants comme le machine learning qui permet d’entraîner un algorithme à reconnaître ces
caractéristiques avant de l’appliquer sur un jeu de données (Vishnepolsky and Pirtskhalava
2014 ; Speck-Planche et al. 2016). Cette méthode est également applicable à la recherche de
peptides avec un domaine d’interaction avec une protéine, un site de reconnaissance pour une
enzyme ou un motif pouvant subir une modification post-traductionnelle (Zatylny-Gaudin et
al. 2016). Malgré l’utilité de ces techniques pour sélectionner les séquences présentant le plus
de probabilité d’être des peptides bioactifs, la recherche d’une activité par des expériences in
vitro ou in vivo, est une étape de validation indispensable.
Après une période d’intense découverte de neuropeptides dans les années 80 et 90, le nombre
de neuropeptides caractérisés au cours de ces dernières annéesa sensiblement décru (Fig. 25).
Cela pourrait être dû au fait que la grande majorité des peptides bioactifs présentant des critères
classiques (issus de précurseurs par clivage enzymatiques, sécrétés par la voie régulée, agissant
140
moins conventionnelles comme c’est le cas par exemple de l’ODN. En effet, l’ODN présente
plusieurs spécificités parmi lesquelles la présence d’une lysine en C-terminal et l’absence de
peptide signal au niveau de son précurseur l’acyl-CoA-binding protein à l’origine d’une
sécrétion par une voie non conventionnelle qui pourrait être de type autophagique (Loomis et
al. 2010). Très récemment, un nouveau type de peptides a aussi été découvert appelés les
micropeptides. Cette avancée a été réalisée en montrant que des ARNs que l’on pensait jusque
là non-codants, sont non seulement très conservés au cours de l’évolution mais aussi régulés
par des facteurs de transcription (Guttman et al. 2009). Il a ensuite été montré que ces ARNs
proviennent de petits cadres de lecture ouverts n’ayant pas été considérés comme des gènes en
raison de leur taille mais présents et conservés par centaines dans le génome de l’Homme et
d’espèces modèles (Ladoukakis et al. 2011 ; Mackowiak et al. 2015). Enfin, les séquences
issues de la traduction de ces ARNs ont été identifiées par spectrométrie de masse (Slavoff et
al. 2013) et certaines présentent un effet biologique sur le développement ou l’activité
transcriptionnelle (Kondo et al. 2007, 2010 ; Chng et al. 2013). Ces quelques exemples
montrent que la recherche de nouveaux neuropeptides ne doit plus se limiter à l’étude des
formes classiques mais doit également prêter attention à des séquences moins conventionnelles
qui pourraient se révéler biologiquement actives.
Figure 25 : Evolution du nombre de neuropeptides découverts depuis 1900. . Les
neuropeptides et leurs dates de découvertes sont issus du Handbook of biologically active
peptides seconde éditionpubliée par AJ. Kastin en 2013 (Academic press).
141
Conclusion et
perspectives
143
L’ensemble des travaux présentés dans cette thèse contribue à la compréhension de
l’implication des peptides dans la mise en place du cortex cérébelleux, et plus particulièrement
au rôle de la nociceptine.
Les peptides impliqués dans le développement du cervelet étant souvent surexprimés pendant
cette phase de développement, une identification et une quantification de ces peptides a été
réalisée par spectrométrie de masse, à partir d’une base de données de tous les neuropeptides et
précurseurs de neuropeptides que nous avons pu identifier. Cela nous a permis de mettre en
évidence que, parmi les 33 neuropeptides exprimés de façon récurrente dans le cervelet de rat,
4 présentent un profil d’expression particulier avec une forte expression pendant le
développement mais qui diminue ensuite à l’âge adulte. Cependant, en raison d’une très faible
concentration en protéines par rapport au stade adulte, nous n’avons pas pu analyser le stade
P1. Dans le but de quantifier les peptides exprimés à ce stade précoce du développement, nous
prévoyons d’analyser ces échantillons en prenant comme référence le stade P8 qui, moins
concentré en protéines que P90, permettra une normalisation plus facile avec les échantillons
provenant des rats nouveaux nés. Si la quantité de peptides reste trop faible pour une détection
dans ce milieu complexe, nous pourrons cibler spécifiquement les peptides que nous avons
trouvés exprimés par targeted MS/MS. Parmi les 4 peptides identifiés comme différentiellement
exprimés au cours du développement, nous avons choisi d’étudier l’implication de la
nociceptine dans la mise en place des neurones en grain du cervelet.
Pour confirmer les résultats obtenus par spectrométrie de masse, l’expression des gènes de la
nociceptine et de son récepteur ont été mesurés dans le cervelet au cours du développement.
Ces 2 gènes présentent une expression transitoire avec une fenêtre temporelle commune, qu’il
conviendra d’affiner en augmentant le nombre de stades étudiés. Afin d’identifier le type
cellulaire et le lieu d’expression de ces gènes, des expériences de microdissection ont été
conduites et ont montré qu’ils sont retrouvés majoritairement dans la couche granulaire interne.
De plus, le gène de la nociceptine et de son récepteur sont exprimés par les neurones en grain
du cervelet qui constituent les cellules majoritaires de cette couche. Afin de renforcer ces
résultats, nous réaliserons un marquage de la nociceptine et de son récepteur par
immunohistochimie, ce qui nous permettra de situer précisément leurs lieux d’expression.
La nociceptine augmente la survie et la différenciation des neurones en grain en culture mais
n’agit pas sur leur migration. Les 2 premiers paramètres étant très liés au cours du
développement, il est possible que l’effet de la nociceptine sur la survie soit à la fois direct en
144
protégeant les neurones lors de leur arrivée dans la couche granulaire interne du cortex, mais
aussi indirect, puisque favoriser la différenciation neuronale permet aux cellules de mieux
résister à la phase d’apoptose tardive. Afin de caractériser les voies intracellulaires impliquées
dans ces processus, nous commencerons par mesurer l’activation ou l’inhibition de différents
seconds messagers par la nociceptine, avant d’utiliser des inhibiteurs spécifiques des voies
activées dont en particulièrement les MAP kinases p-38 et ERK qui sont, selon la littérature,
les plus susceptibles de médier les effets neurotrophiques de la nociceptines. Les expériences
préliminaires réalisées in vivo montrent que le peptide est capable de réduire l’activité des
caspases 3/7 induite par une injection d’éthanol. Afin de confirmer ces premiers résultats, nous
mesurerons l’expression des gènes de ces caspases ainsi que ceux d’autres protéines impliquées
dans la cascade apoptotique tels que Bax et Bcl-2. Nous examinerons ensuite l’histologie du
cortex cérébelleux après injection d’éthanol et/ou de nociceptine afin d’en observer l’effet
potentiel sur l’épaisseur des différentes couches cellulaires. Enfin, nous prévoyons de réaliser
des tests comportementaux sur les ratons comme le test de géotaxie négative ou de
retournement, pour évaluer l’impact de ces injections sur le fonctionnement du cervelet. En plus
des administrations de nociceptine, nous pourrons aussi évaluer le rôle endogène de la
nociceptine en utilisant des animaux chez qui le précurseur du peptide ou le récepteur ont été
invalidés (Sakoori and Murphy 2010).
La réalisation du peptidome du cervelet en développement nous a conduis à identifier 19
séquences issues de précurseurs connus et présentant les caractéristiques de neuropeptides tels
que la présence à l’extrémité de leurs séquences de sites de clivage par les prohormones
convertases. Ces peptides ne possédant aucune activité connue dans la littérature, il sera
intéressant d’étudier leurs effets potentiels sur la migration, la différenciation et/ou la survie
des neurones en grain. Afin de réduire le nombre de ces séquences à 2 ou 3 peptides
synthétisables, nous réaliserons des alignements évolutifs pour mesurer leur degré de
conservation et nous chercherons dans ces séquences la présence de motifs pouvant être
reconnus par des prohormones convertases ou d’acides aminés pouvant être modifiés comme
l’amidation C-terminale. En plus de ces peptides potentiels, le séquençage de novo nous a
permis d’identifier des peptides dont l’expression est récurrente au sein du cervelet. Parmi les
17 séquences, 6 présentent un profil d’expression suggérant leur implication dans le
développement. Après interrogation d’une base de données de protéines de mammifères, nous
avons pu déterminer que ces 6 peptides régulés codent pour des protéines, excluant l’hypothèse
de peptides totalement nouveaux. A ce stade nous effectuerons les mêmes vérifications que
145
pour les 19 séquences issues du peptidome, afin de déterminer si néanmoins ces séquences ne
pourraient pas correspondre à des peptides bioactifs originaires de précurseurs connus, ou s’il
s’agit de produits de dégradation des protéines. Dans ce dernier cas, cela pourrait signifier que
ces protéines, présentes de façon récurrente et régulée au cours du développement, pourraient
avoir un rôle dans la mise en place du cortex cérébelleux.
147
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