PAX5

PAX5 est un facteur de transcription qui joue un rôle important dans la différenciation cellulaire et dans le développement embryonnaire. Il est localisé en 9p13 et possède deux promoteurs distincts (Busslinger et al., 1996). Les ARNm issus de ces deux promoteurs se distinguent par leurs séquences au niveau de l’exon1 (1a et 1b). PAX5b est exprimé au niveau du système nerveux central, des testicules et de la lignée lymphoïde B. En revanche PAX5a est restreint à la lignée lymphoïde B et code une protéine appelée BSAP (B-cell specific activator protein).

La structure de PAX5 est semblable à celle des autres gènes de la famille PAX avec un paired-box domaine, le motif octapeptide et un homéodomaine tronqué. Sa région C-terminale contient un domaine de transactivation et un domaine répresseur (Figure 18a). Le domaine paired box est divisé en deux sous-domaines contenant un motif hélice-boucle-hélice homéodomaine-like et il est caractérisé par une séquence consensus définissant son affinité pour les promoteurs de ses gènes cibles (Figure 18b).

Figure 18 : Structure de PAX5 : a) Représentation de la protéine PAX5 et de ses intéractions

protéiques. b) Séquence consensus du domaine de liaison à l’ADN Paired Box de PAX5. (Holmes ML, Immunology and cell biology, 2008)

La partie N-terminale de PAX5 est capable de recruter les protéines de la famille ETS au niveau du promoteur de certains gènes tel que CD79a (Fitzsimmons et al., 1996). La collaboration de PAX5 et des protéines Ets permet d’augmenter l’expression de CD79a (Nutt et al., 1998). L’activité transcriptionnelle de PAX5 peut également faire intervenir d’autres partenaires en les recrutant via son domaine central et C-terminal. En effet, PAX5 s’associe

au co-activateur transcriptionnel CBP grâce à son domaine de transactivation C-Terminal (Emelyanov et al., 2002). Cependant PAX5 peut également s’associer via son domaine octapeptide aux co-répresseurs de la famille Groucho entraînant une répression transcriptionnelle (Eberhard et al., 2000) (Figure 18a).

PAX5a/BSAP est exprimé du stade Pro-B jusqu’au stade B mature puis son expression s’éteint pour permettre la différenciation plasmocytaire (Figure 19). Dans les souris Pax5-/-, la lymphopoïèse B est complètement stoppée au stade Pro-B suggérant ainsi un rôle majeur de PAX5 dans la différenciation B.

Figure 19 : Expression de PAX5 au cours du développement B

PAX5 est exprimé du stade Pro-B jusqu’au stade B mature. Il régule positivement l’expression de CD19 et réprime Notch1. Son expression s’éteint après le stade B mature pour permettre la différenciation plasmocytaire. (Holmes ML, Immunology and cell biology, 2008)

a) Le développement des cellules B

La cellule B dérive d’une cellule souche hématopoïétique multipotente. Son développement s’effectue au sein de la moelle osseuse chez l’adulte et dans le foie fœtal au stade embryonnaire. La première étape de différentiation se définit par l’apparition du marqueur B220 sur les cellules appelées « pré-pro-B » et par l’expression de gènes spécifiques du développement B. L’apparition du marqueur CD19, cible de PAX5, correspond au stade pro-B. A ce stade se produit le réarrangement des gènes du locus de la chaîne lourde des Ig (d’abord une recombinaison entre un segment D et J, puis un second réarrangement entre un segment V et le complexe DJ). Si ce réarrangement est fonctionnel la

chaîne lourde d’isotype µ est synthétisée et tout autre réarrangement du locus de la chaîne lourde est stoppé. La chaîne lourde µ intracellulaire s’associe avec une pseudo-chaîne légère, composée des 2 protéines λ5 et VpréB, et les chaînes Igα et Igβ pour former le récepteur pré-

réarrangement différent au niveau des gènes de la chaîne légère. Lorsque l’arrêt de l’expression de la pseudo-chaîne légère se produit, il y a disparition du récepteur pré-B de la surface des cellules et réarrangement du locus de la chaîne légère, d’abord sur le locus κ, et s’il n’y a pas eu de réarrangement κ fonctionnel, sur le locus λ. Un réarrangement fonctionnel d’un locus de chaîne légère permet la progression des cellules vers un stade B immature. Les cellules n’ayant pas effectué un réarrangement fonctionnel sont éliminées. Les cellules B immatures expriment des IgM de surface correspondant au BCR. Ces cellules sont capables de reconnaître et de répondre à un antigène (Ag) via le BCR. Ce stade correspond également à l’étape de sélection négative permettant d’acquérir un répertoire de cellules B tolérantes. Les marqueurs CD22, CD23 et CD40 apparaissent à ce stade. Les cellules B matures naïves sont caractérisées par la présence des IgM et IgD de surface. Ces cellules circulent en permanence entre les différents organes lymphoïdes secondaires à la rencontre de l’Ag spécifique. Leur demi-vie est courte en absence de rencontre de l’Ag spécifique (3 jours).

B (ou pré-BCR (B cell receptor)). Une fraction de récepteurs est exportée à la surface cellulaire et la cellule progresse pour devenir une cellule pré-B. L’expression transitoire du pré-BCR est le premier point de contrôle du développement B (seules 55% des cellules atteignent le stade pré-B). Puis, on observe une étape de prolifération générant de multiples cellules pré-B identiques. Chaque cellule pourra effectuer un

Si la rencontre avec l’Ag spécifique a lieu, on passe à la seconde étape du développement dépendante de l’Ag. La coopération du LB avec le LT CD4+ Th2 spécifique du même Ag est nécessaire à la différenciation en LB effecteur. Cette collaboration fait intervenir des protéines de membranes (CD40 du LB avec CD40L du LT) et des cytokines sécrétées (IL4, IL5, IL6 et IL10). Une petite partie de ces cellules B se transforme rapidement en plasmocytes sécréteurs d’Ac de faible affinité. Une grande partie de ces cellules B vont effectuer la commutation isotypique (switch) de la chaîne lourde de l’Ig (changement de la classe de l’Ig) et l’hypermutation somatique (modification de l’affinité pour l’Ag). Les cellules B matures dont le BCR présente une maturation d’affinité pour l’Ag seront sélectionnées positivement et poursuivront leur différenciation soit en plasmocytes sécréteurs d’Ac, soit en cellules mémoires qui permettront une réponse secondaire plus rapide et plus efficace.

b) Expression de PAX5 au cours du développement B

La différentiation des cellules B dépend des protéines E2A, EBF1 et PAX5. En effet, l’inactivation d’un de ces gènes entraîne un blocage de différenciation précoce (Busslinger, 2004). La lymphopoïèse B est stoppée avant le stade des progéniteurs B220+ dans le foie fœtal des embryons Pax5-/-. Par contre, la différenciation B atteint le stade pro-B (c-Kit+, B220+) dans la moelle osseuse des souris Pax5-/-, suggérant une différence de régulation par Pax5 entre la lymphopoïèse B fœtale et adulte (Nutt et al., 1997; Urbanek et al., 1994). Les cellules pro-B Pax5-/- sont incapables de se différencier en cellules matures sans une restauration de l’expression de Pax5. Ces cellules peuvent être maintenues en culture sur des cellules stromales et proliférer en présence de l’interleukine IL-7.

De façon surprenante, lorsqu’on remplace l’IL-7 par des cytokines spécifiques d’autres lignées, les cellules pro-B Pax5-/- sont capables in vitro de se différencier en macrophages, granulocytes, cellules Natural Killer, cellules dendritiques et ostéoclastes (Nutt et al., 1999) (Figure 21). Transplantées dans la moelle osseuse de souris porteuses, ces cellules pro-B Pax5-/- sont également capables de se renouvelées et de développer tous les types cellulaires mentionnés précédemment (Nutt et al., 1999; Rolink et al., 1999). De plus, ces cellules peuvent complètement restaurer le développement des thymocytes de souris Rag2-/- (Rolink et al., 1999) et se différencier in vitro en cellules T sur une monocouche de cellule stromale

OP9 exprimant DL1 (Notch ligand Delta-like 1) (Hoflinger et al., 2004). PAX5 joue un rôle crucial dans la différenciation B en inactivant les autres voies de différenciation.

Figure 21 : Plasticité des cellules pro-B Pax5-/-

L’inactivation de Pax5 bloque la différenciation à un stade Pro-B. Ces cellules sont capables de se différencier en granulocytes, en cellules dendritiques, en macrophages, en ostéoclastes, en cellules NK et en cellules T. (Cobaleda C, Nature Immunology, 2007)

En revanche, Pax5 n’est pas capable d’induire une différenciation B si l’on force son expression dans les cellules souches hématopoïétiques ou dans les progéniteurs erytro-

Récemment, l’équipe de Busslinger a démontré que l’inactivation de Pax5 dans les cellules B matures entraine une dédifférenciation jusqu’au stade pro-B d’un pool de cellules au bout d’une semaine. Ces cellules sont également capables de reconstituer le compartiment T de souris (cellules T -) (Cobaleda et

al., 2007) (Figure 22). Figure 22 : Dédifférenciation des cellules B Pax5-/- en

myéloïdes (Anderson et al., 2007; Cotta et al., 2003). Cependant, une expression précoce de Pax5 dans les progéniteurs lymphoïdes entraîne une forte différenciation vers la lignée B au dépend de la lignée T (Cotta et al., 2003; Souabni et al., 2002). Ainsi, selon le contexte, Pax5 semble dépendre d’une collaboration avec d’autres facteurs de transcription lymphoïdes pour promouvoir la différenciation B.

c) Régulation de PAX5

La régulation de l’expression de Pax5 est très peu connue. La chronologie d’expression des facteurs de transcription lymphoïdes place PU.1, Ikaros, E2A et EBF1 en amont de Pax5 étant donné qu’ils sont exprimés dans les cellules Pro-B Pax5-/- (Nutt et al., 1997) (Figure 23).

Figure 23 : Expression et régulation des protéines PU.1, Ikaros, E2A, EBF1 et PAX5 dans les stades précoces de différenciation B. PU.1 régule le récepteur à l’IL-7, FLT3, le marqueur B220 et

EBF1. Ikaros régule FLT3. E2A régule EBF1. EBF1 régule PAX5 et la formation du pré-BCR. PAX5 régule EBF1, le marqueur CD19 et la formation du pré-BCR. (Nutt SL, Immunity, 2007)

Le niveau d’expression de Pax5 est diminué dans les cellules pro-B E2a+/-,Ebf1+/- de souris (O'Riordan and Grosschedl, 1999) et l’expression de Ebf1 dans les souris E2a-/- induit une différenciation jusqu’au stade pro-B en activant Pax5 (Seet et al., 2004). Ces résultats suggèrent une régulation de Pax5 par Ebf1. De plus, EBF1 et STAT5 sont capables de se lier sur les séquences en amont de l’exon 1A de Pax5 (Hirokawa et al., 2003; O'Riordan and

Grosschedl, 1999). Ces résultats ont besoin d’être complétés par une caractérisation fonctionnelle du promoteur de Pax5 et des éléments enhancers pour définir précisément la régulation de Pax5.

De manière intéressante, EBF1 est capable d’activer la transcription de PAX5, mais PAX5 est lui-même capable de réguler l’expression de EBF1, permettant de maintenir son expression dans les lymphocytes B (Fuxa et al., 2004; Nera et al., 2006; Roessler et al., 2007). Afin de déterminer la régulation de l’expression de Pax5, Fuxa et coll. ont mis en place un modèle de souris transgéniques dans lequel chacun des deux allèles de Pax5 contient dans sa partie 3’ non traduite un site IRES suivi soit du gène codant la GFP, soit du gène indicateur CD2 (antigène de surface des lymphocytes T) humain tronqué dans sa partie intracellulaire, permettant ainsi de suivre l’expression de chaque allèle indépendamment. Ce modèle a permis de démontrer une expression bi-allélique de Pax5 tout au long du développement, du stade pro-B jusqu’au stade B mature (Fuxa and Busslinger, 2007).

d) Répression transcriptionnelle par PAX5

PAX5 joue donc un rôle déterminant dans l'ontogenèse B et dans l'engagement irréversible vers la voie de différenciation B. Le pouvoir de dédifférenciation des cellules pro- B Pax5-/- s’explique par la capacité de Pax5 à réprimer l’expression de gènes contrôlant les autres voies de différenciation. En effet, il est capable de réprimer la transcription de Notch1 (Souabni et al., 2002), nécessaire à la différenciation T, ou la transcription de M-CSF-R (Nutt et al., 1999) ce qui rend les précurseurs B insensibles aux cytokines myéloïdes telles que M- CSF. Ce mécanisme n’est pas complètement compris, mais il a été démontré que Pax5 était capable de recruter les corépresseurs de la famille Groucho afin d’entraîner une répression transcriptionnelle. Les cibles réprimées par Pax5 ont été recherchées par l’étude du transcriptome. Delogu et coll. ont identifié 110 gènes codant des protéines impliquées dans la communication intercellulaire, dans l’adhésion, la migration, ainsi que dans le métabolisme cellulaire (Delogu et al., 2006) (Tableau 5).

Certains de ces gènes tel que Cd28 sont exprimés avant l’expression de Pax5 puis réexprimés lors de la différenciation plasmocytaire. Pax5 réprime l’expression de gènes codant des récepteurs de surface et des protéines de transduction de signal qui interviennent dans les progéniteurs très précoces ou dans différentes lignées hématopoïétiques. Parmi les protéines de surface on retrouve le récepteur Flt3 (Delogu et al., 2006; Holmes et al., 2006) ou la protéine Ly6a (Sca1) qui contrôlent la prolifération et la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques, la sous-unité Ramp1 du récepteur CGRP (calcitonin gene-related peptide) qui est impliqué dans le développement myéloïde, ou le récepteur Gp49b (Lilrb4) qui est exprimé par les cellules NK (Delogu et al., 2006).

Les molécules de signalisation réprimées par Pax5 comprennent la molécule adaptatrice Grap2 (Mona) du (pré) récepteur T et du récepteur M-CSF et l’adaptateur transmembranaire NTAL (Lat2) des récepteurs Fcγ et Fcε (Delogu et al., 2006).

Les progéniteurs lymphoïdes modifient leurs propriétés adhésives et migratoires au cours du développement étant donné que les cellules pré-pro-B et pro-B se logent dans des niches différentes au sein de la moelle osseuse (Tokoyoda et al., 2004). En accord avec cette observation, Pax5 réprime l’expression des chimiokines CCL3 et CCL9, des récepteurs aux chimiokines CCR2 et CCR5, de la sous-unité αL du récepteur aux intégrines (Itgal) LFA-1 ou de la protéine associée aux intégrines CD47 (Delogu et al., 2006).

Tableau 5 : Cibles de PAX5.

En rouge les cibles réprimées par PAX5, en vert les cibles activées par PAX5.

(Cobaleda C, Nature Immunology, 2007)

Holmes et coll. ont transduit des cellules souches hématopoïétiques avec un rétrovirus permettant l’expression de Flt3. Les auteurs démontrent que la présence de Flt3 empêche un développement B et que donc la répression de Flt3 par Pax5 est essentielle à la différenciation B (Holmes et al., 2006). De plus, l’identification de Flt3 et de M-Csf-R comme cibles de Pax5 a permis de démontrer que Pax5 était capable de réprimer ces cibles en se liant à leurs promoteurs (Holmes et al., 2006; Tagoh et al., 2006).

e) Activation transcriptionnelle par PAX5

L’activation de gènes spécifiques de la lignée B est la seconde fonction tout aussi importante de PAX5. L’identification de gènes activés par PAX5 a permis de révéler un rôle

L’expression de Cd19 et de Blnk semble être complètement dépendante de Pax5 étant donné que les cellules des souris Cd19-/-Blnk-/- sont bloquées à la transition pro-B/pré-B (Hayashi et al., 2003). PAX5 régule également l’expression du facteur de transcription LEF-1 (Nutt et al., 1998), la tyrosine kinase BLK ou la recombinase RAG2 et maintient l’expression de EBF1 (Fuxa et al., 2004; Roessler et al., 2007).

essentiel de PAX5 dans le contrôle de la transduction du signal via le pre-BCR (Figure 24) et le BCR (Busslinger, 2004). En effet, PAX5 active l’expression de

CD79a (MB1 ou Igα)

(Fitzsimmons et al., 1996; Nutt et al., 1997), des corécepteurs activateurs CD19 et CD21 (Horcher et al., 2001; Kozmik et al., 1992; Nutt et al., 1998), du corécepteur inhibiteur CD72 (Ying et al., 1998) et de la protéine adaptatrice BLNK (Schebesta et al., 2002).

Figure 24 : Régulation du pré-BCR par Pax5.

En rouge, les gènes régulés par Pax5.

Schebesta et coll. ont comparé le profil d’expression des cellules pro-B de souris Pax5+/+ et Pax5-/- (Schebesta et al., 2007). 170 gènes sont décrits comme étant dépendants de Pax5. Cette étude confirme une régulation par Pax5 de cibles déjà décrites telles que Mb1, Cd19, Blnk ou Bcl-xL. Cette étude révèle que Pax5 régule des gènes codant des protéines de fonctions très diverses telles que des récepteurs de surface, protéines de signalisation, des protéines nucléaires. Ces protéines nucléaires incluent Spib, Irf4, Irf8, Bach2, and Ikzf3 (Aiolos), qui régulent la formation du centre germinatif B. D’autres cibles de Pax5 codent des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire, le trafic protéique, le cytosquelette, la migration cellulaire et l’adhésion. Afin de déterminer l’importance du maintien de l’expression de Pax5 dans les cellules pro-B, les auteurs ont utilisé un modèle de souris Cre-récepteur aux œstrogènes permettant de déléter Pax5 en présence d’œstrogènes. Après délétion de Pax5, beaucoup de cibles identifiées sont réprimées, confirmant les résultats obtenus.

Enfin, les cellules pro-B Pax5-/- présentent un réarrangement des IgH inefficace et une absence de réarrangement des chaines légères. Pax5 est donc indispensable à la différenciation B et au réarrangement des immunoglobulines (Urbanek et al., 1994).

Pax5 est essentiel tout au long de la différentiation B jusqu’au stade B mature, cependant l’extinction de Pax5 est nécessaire pour permettre la différentiation plasmocytaire. Schebesta et coll. (2007) ont étudié par RT-PCR le transcriptome des populations plasmatiques et ont démontré que la moitié des cibles de Pax5 étaient réprimées. Cependant, certaines cibles de Pax5 telles que Nedd9, Blnk et Irf4 continuent à être exprimées en absence de Pax5. Pax5 n’est donc pas indispensable au stade plasmocytaire pour maintenir l’expression de certaines de ses cibles. De plus, il semblerait que l’extinction de Pax5 soit suffisante pour permettre le passage du stade B mature vers le préplasmocyte (Kallies et al., 2007).

f) Rôle oncogénique de PAX5

PAX5 est impliqué dans différentes translocations, notamment dans certains cas de lymphomes non hodgkiniens porteurs de la t(9;14)(p13;q32) où le gène PAX5 est juxtaposé au

gène codant pour la chaîne lourde des immunoglobulines. D’autres variantes de réarrangements de PAX5 permettent l’obtention d’une protéine de fusion, notamment PAX5- ETV6 dans les LAL-B.

(1) PAX5-IgH

La translocation t(9;14)(p12;q32) est retrouvée dans 2% des lymphomes non hodgkiniens et plus précisément dans des lymphomes lymphoplasmocytaires (LPL). Cette translocation a tout d’abord été décrite dans la lignée KIS-1 établie à partir d’un patient atteint de lymphome diffus à grandes cellules (Ohno et al., 1990). L’étude de cette lignée a permis de démontrer que le locus de la chaîne lourde des immunoglobulines était réarrangé avec une région chromosomique située en 9p13. L’utilisation de sondes correspondant aux séquences en 14q32, proches du point de cassure, révèle la présence d’un transcrit d’environ 11kb par Northern Blot dans les cellules porteuses de la translocation t(9;14) (Ohno et al., 1990). En 1996, Busslinger et coll. démontrèrent par Southern blot que le point de cassure sur le chromosome 9 se situait à 1807 pb du 1er exon de PAX5. La translocation t(9;14) juxtapose les gènes PAX5 et IgH en sens opposé de transcription. L’exon 1A de PAX5 se retrouve à proximité de l’enhancer Eµ ce qui entraîne une surexpression de PAX5 dans la lignée KIS-1 11 fois supérieure à l’expression basale de PAX5 (Iida et al., 1996) (Figure25).

Figure 25 : Structure du réarrangement PAX5-IGH. La translocation conduit à la juxtaposition de l’enhancer Eµ des IGH en amont de l’exon 1A de PAX5. (Cobaleda C, Nature Immunology, 2007)

Cette translocation a par la suite été décrite dans des lymphomes du manteau, folliculaires et les lymphomes spléniques de la zone marginale. Souabni et coll. ont reconstitué la translocation t(9;14) dans des souris knock in (KI) en insérant un minigène dans le locus des IgH. Dans ce modèle, Pax5 est exprimé dans la lignée lymphoïde où il interfère avec le développement T en activant les gènes spécifiques de la lignée B et en réprimant les

gènes du développement T. Ces souris Igh-Pax5 développent des lymphomes T agressifs, ce qui démontre que la lignée T est très sensible à l’action oncogénique de Pax5 (Souabni et al., 2007).

(2) PAX5-ETV6

La translocation dic(9;12)(p13;p13) est associée à des leucémies aiguës lymphoblastiques B. Ce réarrangement conduit à la formation d’un chromosome dicentrique (dic) qui contient deux centromères. Afin d’identifier les gènes impliqués dans cette translocation, Cazzanigga et coll. ont tout d’abord recherché quels pouvaient être les bons candidats. ETV6, situé en 12p13, au niveau du point de cassure, était déjà décrit dans de nombreux réarrangements (18 rapportés). Le réarrangement de ETV6 dans cette translocation a été démontré par FISH et Northern Blot (Tosi et al., 1998). L’utilisation de cosmides a permis de démontrer que le point de cassure se situait entre les exons 2 et 3 de ETV6. Afin d’identifier le partenaire de ETV6, les auteurs ont utilisé la technique de RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends). Après séquençage, ils ont pu identifier PAX5 comme partenaire de ETV6. La translocation dic(9;12) fusionne l’exon 4 de PAX5 à l’exon 3 de ETV6. Au niveau protéique, la chimère conserve le domaine paired box de PAX5 et les domaines de dimérisation HLH et de liaison à l’ADN ETS de ETV6. De plus, les transcrits PAX5A-ETV6 et PAX5B-ETV6, correspondant aux deux promoteurs de PAX5, ont pu être détectés (Cazzaniga et al., 2001). Le niveau d’expression de CD19, une cible de PAX5, a été évalué par RT-PCR chez les patients porteurs de la dic(9;12), mais aucune différence significative n’a pu être observée. Ce résultat suggère que PAX5-ETV6 n’a pas d’effet sur CD19 et que l’autre allèle de PAX5 est suffisant à son expression (Strehl et al., 2003).

Figure 26 : Structure de la protéine de fusion PAX5-ETV6 (TEL)