B. PRINCIPE DE L’IRM
IX. PARTICULARITES DE L’IRM HAUT CHAMP 3 TESLA ET PLUS
III.1.1 Equipamentos
III.1.1.1 Testes qualitativos preliminares
Todos os ensaios preliminares qualitativos dessa etapa do trabalho foram realizados em um espectrofotômetro UV-VIS HP 8453 com cubeta de quartzo e caminho óptico de 1,0 cm.
III.1.1.2 Sistema de análise em fluxo automático empregando multi- bombas (MPFS) com detecção espectrofotométrica
Para a obtenção dos resultados experimentais utilizando o sistema MPFS, foram utilizadas duas micro-bombas solenóides automáticas de 20 L (120SP1220) e uma de 10L (120SP1210) de capacidade da marca Bio-chem Valve Inc; uma cubeta de fluxo de quartzo com b = 1,0 cm e 18L de volume interno; conectores e tubos de polietileno com 0,8 mm de diâmetro interno e confluência de acrílico em X (quatro vias) para transporte e mistura das soluções. O sistema de detecção consistiu de um espectrofotômetro Ocean Optics UBS 4000 conectado a uma fonte de luz UV-Vis modelo USB-ISS. O registro dos dados foi realizado por um microcomputador tipo IBM-PC Pentium II equipado com o softwate Ocean Optics SpectraSuite. Um outro microcomputador foi utilizado para controlar as microbombas através de uma interface eletrônica (PCL 711 Advantech interface card) e software Quick Basic
4.5. Softwares estatísticos como o Minitab 16, Statistica 7.0 foram utilizados
para o planejamento experimental e Origin 7.0/Excel 2010 para tratamento dos dados.
III.1.1.3 Método de referência
Para a obtenção dos resultados pelos métodos de referência foi utilizado um Cromatrógráfo Líquido de Alta Eficiência SHIMADZU Proeminence – 20AT acoplado a um detector UV de arranjo de fotodiodos (DAD). Foram utilizados
36 dois métodos de referência. Para análise de norfloxacina, ciprofloxacina e enrofloxacina, foi utilizado o método proposto por Cañada et al (2007, p. 1242- 1249). Foi utilizada uma coluna cromatográfica OMNISPHER 5 RP C18 150mm x 4,6mm; 5m Varian e a fase móvel, composta por uma mistura de metanol- acetonitrila-tampão citrato 10 mmol L-1 a pH 3,5. Para a análise de
levofloxacina, foi utilizado o método proposto por Nur et al (2013, p. 633-638) e uma coluna cromatográfica C-18 250mm x 4,6mm; 5m. A fase móvel utilizada no método consistiu de uma mistura acetonitrila-ácido acético 10%
III.1.2 Reagentes e padrões
Todos os reagentes e padrões utilizados nos experimentos são de grau analítico e nas diluições, utilizou-se água deionizada obtida do Deionizador Millipore Milli-Q plus (membrana Millipore 0,22 m, resistividade 18,02 M.cm e temperatura 25º C).
a) N-bromosuccinimida (NBS) - ALDRICH, pureza 99% b) Dodecil sulfato de sódio (SDS) - SIGMA ALDRICH
c) Ácido clorídrico fumegante – MERCK – 37 %, d = 1,19 g cm-3 d) Padrão de norfloxacina – (pureza 99,97 %, Purifarma)
e) Padrão de cloridrato de ciprofloxacina – (pureza 100,0 %, Purifarma) f) Padrão de enrofloxacina –(pureza 99.97%, Sigma Aldrich)
g) Padrão de hemiidrato de levofloxaxina(pureza 99.97%)
h) Excipientes de grau farmacêutico: celulose microcristalina, dióxido de silício, hidroxipropilmetilcelulose, polietilenoglicol (PEG 6000), lactose, dióxido de titânio, amido, talco, polivinilpirrolidona (PVP), estearato de magnésio, manitol, frutose, glicose e cloreto de benzalcônio.
37 III.1.3 Preparo das soluções
III.1.3.1 Soluções padrão
Soluções padrão de norfloxacina e enrofloxacina
Soluções estoque de norfloxacina e enrofloxacina 500 g mL-1 foram preparadas individualmente dissolvendo-se 50 mg do padrão em 9,6 mL de HCl 1,042 mol L-1 (concentração final 0,10 mol L-1) e posteriormente transferidos a um balão volumétrico de 100,00 mL e completado com água ultrapura Milli-Q.
Solução padrão de ciprofloxacina
Solução estoque de ciprofloxacina 500 g mL-1 foi preparada dissolvendo-se
58,3 mg do padrão de cloridrato de ciprofloxacina em 9,6 mL de HCl 1,042 mol L-1 (concentração final 0,10 mol L-1) e posteriormente transferidos a um balão
volumétrico de 100,00 mL e completado com água ultrapura Milli-Q.
Solução padrão de levofloxacina
Solução estoque de levofloxacina 500 g mL-1 foi preparada dissolvendo-se 51,5 mg do padrão de cloridrato de ciprofloxacina em 9,6 mL de HCl 1,042 mol L-1 (concentração final 0,10 mol L-1) e posteriormente transferidos a um balão
volumétrico de 100,00 mL e completado com água ultrapura Milli-Q. III.1.3.2 Soluções estoque do reagente cromogênico
Soluções de n-bromossucinimida (NBS) 0,01 mol L-1 e 0,06 mol L-1 foram
preparadas dissolvendo-se 89,0 e 267,0 mg, respectivamente, do sólido em água ultrapura Milli-Q e posteriormente transferidos a um balão volumétrico de 25,00 mL e completado com água ultrapura Milli-Q.
38 III.1.3.3 Solução estoque de SDS
Solução estoque do surfactante aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,1 mol L-1 foi preparada dissolvendo-se 2,9 g do sólido em água deionizada e transferida a um balão volumétrico de 100,00 mL.
III.1.4 Preparo das Amostras
Comprimidos
O conteúdo de uma caixa (sete ou dez comprimidos, no caso do medicamento veterinário) da amostra comercial foi pesado em balança analítica, determinado o valor médio das massas e então pulverizados em gral de ágata e homogeneizados. Foi pesada uma massa de medicamento contendo aproximadamente 20 mg do princípio ativo, a qual foi solubilizada em 9,6 mL de solução de HCl 1,042 mol L-1; em seguida, a mistura foi transferida para um
balão volumétrico de 100,00 mL; o volume completado com água deionizada e sonicada por 10 minutos. Em seguida, a mistura foi filtrada em papel de filtro Whatman nº41 e uma alíquota de 2,50 mL do filtrado foi transferida a um balão volumétrico de 25,00 mL contendo 2,50 mL de solução de SDS 0,10 mol L-1 e o
volume completado com água deionizada (concentração final HCl 0,01 mol L-1
e SDS 0,010 mol L-1). Para as amostras cujos comprimidos eram revestidos
com corantes, a solução de trabalho foi filtrada com membrana Miilipore 0,45 m antes de se proceder a análise.
Solução (injetável, oral ou oftálmica)
Uma alíquota de amostra equivalente a 20 mg do princípio ativo foi transferida a um balão volumétrico de 100,00 mL e adicionado 966 mL de HCl 1,042 mol L-
1, o menisco foi completado com água deionizada e a mistura sonicada por 10
minutos. Uma alíquota de 2,50 mL dessa solução foi transferida a um balão volumétrico de 25,00 mL contendo 2,50 mL de solução de SDS 0,10 mol L-1 e o
volume completado com água deionizada (concentração final HCl 0,01 mol L-1
39 III.2 Metodologias
III.2.1 Ensaios qualitativos preliminares
Após uma análise da literatura, foram realizados testes preliminares (qualitativos) em solução onde se estudou a sensibilidade da reação das fluoroquinolonas do presente estudo frente ao cromogênico NBS, para posterior estudo de metodologias aplicadas a análise por injeção em fluxo com detecção espectrofotométrica na região do visível. Com o objetivo de aumentar a sensibilidade foram utilizadas algumas estratégias como o uso de surfactantes (ROCHA, 2004) e aumento na temperatura da reação.
III.2.2 Sistema em fluxo automático empregando multi-bombas (MPFS)
O procedimento de análise em fluxo adotado no presente trabalho consistiu na utilização de três micro-bombas solenóides automáticas (P1, P2 e P3) controladas por um software (microcomputador PC1). A micro-bomba P1 (com capacidade de 10 L por pulso) impulsiona a solução do reagente cromogênico. Já as micro- bombas P3 e P2 (ambas com capacidade de 20 L por pulso) impulsionam as soluções carregadora e de amostra, respectivamente. O software foi configurado de acordo com a estratégia de amostragem binária. Essa estratégia consiste na injeção pulsada intercalada de alíquotas de ambas as soluções criando múltiplas interfaces de reação, onde ocorre dispersão, promovendo uma mistura eficiente. A combinação da amostragem binária com o fluxo pulsado criado pelas micro- bombas solenóides promove uma homogeneização ainda mais rápida e eficiente, favorecendo o desenvolvimento da reação. O sistema MPFS está representado na Figura 08.
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Figura 08: Esquema do sistema MPFS. P1: microbomba do reagente (R); P2: microbomda da amostra (A); P3: microbomba da solução carregadora (CA). D: descarte; X: confluência; RC: bobina reacional; W: fonte de luz (USB-ISS UV-Vis); E: detector (USB4000); C: cubeta de fluxo
(b=1,0cm). [fonte: elaborado pelo próprio autor]