Les paramètres hélicoïdaux inter-paire de base décrivent les 3 translations et les 3 rotations entre deux paires de base successives.
Figure 33 – Conformation BI et BII des phosphates de l’ADN B. Représentation de deux
dinucléotides où les groupements phosphates sont en BI (à gauche) ou en BII (à droite). L’atome de phosphore du groupement phosphate est représenté en jaune et les oxygènes du groupement phosphate en rouge.
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Sillons de l’ADN
L’ADN B est caractérisé par sa conformation en double hélice et ses deux sillons inégaux, le grand et le petit sillon (Figure 35). Nous allons voir que la largeur des petits sillons joue un rôle important dans les interactions avec les histones (Chapitre 3 : Dynamique de l’ADN dans le nucléosome, p. 129). La mesure de la largeur du petit sillon s’effectue dans Curves+ entre deux points des brins I et J qui ne correspondent pas à une paire de base, mais à deux bases décalées en moyenne de 2,5 nucléotides (Figure 35).
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Figure 35 – Représentation schématique du grand et du petit sillon de l’ADN. Ni est le nucléotide
à la position i sur le brin I et Nj le nucléotide du brin J qui lui est apparié. Wmg correspond à la largeur du petit sillon.
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Méthode PhAST
La méthode PhAST (Photochemical Analysis of Structural Transitions) a été initialement mise au point par Malcolm Buckle et son groupe (Hatakeyama et al. 2016). C’est une approche expérimentale non-invasive et qui ne requiert aucune modification chimique des macromolécules que l’on veut étudier, contrairement à des techniques de fluorescence par exemple. Elle nous a permis de faire une analyse précise de l’assemblage et du désassemblage du nucléosome dans les mêmes conditions.
Figure 36 – Représentation schématique de la formation d’un dimère de thymine T^T. A gauche,
deux thymines qui se suivent (TpT) sur un brin d’ADN sont soumise à un rayonnement UV et se dimérisent (droite) selon un rendement quantique qui reste faible.
PhAST consiste à mesurer la probabilité de formation d’un dimère de pyrimidine entre deux pyrimidines adjacentes (YpY) localisées sur le même brin d’ADN après irradiation UV (Figure 36). La probabilité de former un dimère est modulée par la nature chimique des pyrimidines (les cytosines ont un plus faible rendement que les thymines) et par la structure locale de l’ADN. Un dimère YpY étant formé grâce à deux liaisons C5-C5 et C6-C6, tout élément de structure rapprochant ces deux atomes favorise l’apparition d’un dimère. Un roll positif, associé à un petit twist augmente ainsi la probabilité d’obtenir un dimère (Hatakeyama et al. 2016).
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Figure 37 – Exemple d’une mesure PhAST sur un pas TpT. La complexation de l’ADN avec une
protéine entraine un changement dans la structure locale de l’ADN (panneau du haut). Dans cet exemple, les positions relatives des deux thymines successives sont plus favorables à la formation de dimère dans l’ADN libre (roll ~0) que dans l’ADN lié (roll < 0) ; la fixation de la protéine s’accompagne d’une diminution du pic d’intensité représentatif de la population T^T.
63 Afin d’analyser le comportement de l’ADN lors de l’assemblage et du désassemblage du nucléosome, deux expériences sont faites en parallèle, une sur l’ADN complexé et une sur l’ADN libre (Figure 37). Une fois l’irradiation UV effectuée, on associe à chaque pas YpY un signal dont l’intensité reflète la population du dimère Y^Y. Si l’intensité des pics pour l’ADN libre et pour l’ADN complexé est identique, alors la structure de l’ADN complexé est comparable à celle du l’ADN libre. Des intensités différentes témoignent d’un changement de structure locale (par exemple, un roll plus faible) que, dans le cas du nucléosome nous avons relié aux interactions avec une histone.
Dans la pratique, on calcule le log2 du ratio de l’intensité du pic de l’ADN complexé sur l’intensité du pic de l’ADN libre. Ainsi, lorsque la propension à former un dimère de pyrimidine diminue dans l’ADN complexé, on observe un 𝑙𝑜𝑔2(𝐼𝑅) négatif. Au contraire, un 𝑙𝑜𝑔2(𝐼𝑅) positif témoigne d’une augmentation de la propension à former un dimère de pyrimidine dans l’ADN complexé. Lorsque la structure de l’ADN complexé se rapproche de celle de l’ADN libre, le 𝑙𝑜𝑔2(𝐼𝑅) tend vers 0.
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Chapitre 1 : Interface ADN/Histones dans le
nucléosome
Sommaire
1Afin de jouer son rôle de compaction de l’ADN dans les cellules eucaryotes, le complexe nucléosomal doit être capable de se former avec des séquences d’ADN de composition variable. Mais dans tous les cas, il impose une courbure importante à la double hélice. Cette courbure régulière, d’environ 30° pour dix paires de bases, n’est pas observée dans l’ADN libre, quelle que soit la séquence. Les histones doivent donc induire puis maintenir l’ADN dans un état courbé et donc stressé.
L’organisation globale de cette interface a été résolue avec les premières structures cristallographiques du nucléosome. L’interface est décrite par 14 sites de fixation, un toutes les 10 paires de base le long de l’ADN (Article 1 – Figure 1A, 1B). Chacun de ces points de contact est caractérisé par une arginine interagissant avec le petit sillon de l’ADN et l’interface est donc considérée comme ayant un fort caractère électrostatique. Mais ces interactions paraissent peu de chose au regard des distorsions de l’ADN qui doivent être préservées. C’est pourquoi il a aussi été proposé que de nombreuses liaisons hydrogène médiées par des molécules d’eau renforçaient les contacts directs entre ADN et histone. Cependant, ces descriptions de l’interface proviennent d’analyses limitées aux liaisons hydrogène, utilisant en particulier HBplus, et de par la nature cristallographique des complexes, ne peuvent pas donner d’informations sur la dynamique et la stabilité des contacts. Enfin, elles ne prennent en compte que les domaines structurés des histones, les queues étant très mal voire pas du tout résolues en cristallographie.
Le but de ce premier travail était de décrire une interface ADN-histone en solution, qui pourrait servir de référence. Pour cela, nous avons produit 1.2µs de simulations de dynamique moléculaire du nucléosome en solution explicite, c’est-à-dire dans un solvant à 0.15M NaCl, avec les modèles et selon le protocole décrit dans la section dynamique moléculaire du nucléosome (p. 55). Ce nucléosome est composé d’histones issues de Xenopus laevis ainsi que de la séquence d’ADN dite 601. Cette séquence a été choisie à cause de sa forte affinité pour les histones qui suggère une interface particulièrement solide. De plus, son caractère fortement positionnant la rend très pratique à utiliser lors d’expériences, comme celles menées par M. Buckle et C. Nogues que je décrirai plus tard.
1 L’ensembles des références de cette section peuvent-être trouvées dans l’article associé au chapitre (p. 72) et dans l’introduction de ce manuscrit (Le nucléosome, p. 17)
65 Nous avons analysé les simulations avec le programme VLDM, qui permet de caractériser chaque interaction ADN/protéine en termes de surface et d’occurrence de contact. Dans la première partie de l’article, nous avons répertorié l’ensemble des acides aminés et des nucléotides impliqués dans l’interface. Nous relevons que les contacts sont très stables au cours de la dynamique à l’exception de ceux impliquant les parties N-terminales des queues d’histones et les extrémités de l’ADN. En regroupant les contacts par SHL on retrouve une interface très symétrique par rapport au centre de l’ADN, que ce soit pour le cœur (Article 1 – Figure 4) ou les racines des queues d’histone (Article 1 – Figure 6). Puisque les deux moitiés de la séquence 601 ne sont pas symétriques (non palindromiques), l’effet de la séquence de l’ADN semble donc négligeable sur l’interface. Nous soulignons l’importance des contacts hydrophobes, souvent négligés dans la littérature mais dont la contribution en termes de surface est équivalente voire supérieure aux contacts électrostatiques. Nous avons montré que contrairement à ce que montraient les études cristallographiques, aucune molécule d’eau n’est piégée de manière systématique et durable au niveau de l’interface ADN/Histone. Les liaisons hydrogène entre l’eau et le nucléosome sont donc transitoires et n’ont donc pas un rôle clé dans le maintien du complexe.
Nous avons ensuite analysé les densités de cations (Na+) à l’interface ADN/histones mais également autour du nucléosome (Article 1 – Figure 8). Bien que certaines positions de l’interface ADN/histones semblent favoriser la présence d’un ion, nous ne retrouvons pas d’ions piégés systématiquement dans toutes les dynamiques. En revanche, nous avons mis en évidence la présence d’un nuage de cations Na+ entre les deux doubles hélices de l’ADN qui sont superposées dans le nucléosome ; ce nuage permet de faire bouclier entre les groupements phosphates très proches et donc hautement répulsifs.