Paramètres de lyse des phages 14.1, LUZ7 et B1 :

Il est possible de suivre la multiplication des phages dans le temps en suivant leur concentration dans d’une culture. Une courbe est ainsi obtenue, elle commence par une période de latence ou d’éclipse. Pendant cette phase de l’infection, l’adsorption, l’injection et la synthèse de nouveaux ADN viraux et de nouvelles protéines ont lieu. La phase suivante est appelée maturation ou stade de libération (semblable à la phase logarithmique chez les bactéries) et correspond à la phase de libération des particules de phages nouvellement synthétisées. Le cycle peut alors recommencer avec l'infection de nouvelles cellules. L’expérience décrite par Ellis et Delbrück (Ellis and Delbrück, 1939) a permis de mettre en évidence cette réplication cyclique des phages et d’en isoler la première étape.

Figure 40 : Amplifications des phages 14.1 en milieu minéral minimum

Dans l’erlenmeyer à gauche de la figure, la culture bactérienne est en phase exponentielle, les concentrations très élevées en bactéries sont visibles à l’œil nu. A droite, la multiplication des phages durant les 12h à 30°C a entraîné la lyse des bactéries laissant apparaître un milieu de culture plus limpide.

1,00E+08 1,00E+09 1,00E+10 1,00E+11

PF

U

127 L’expérience a été réalisée avec les phages 14.1 et les phages LUZ7 dans un premier temps en présence

de la souche hôte de référence de P. aeruginosa PAO1. En ce qui concerne les phages 14.1, deux essais ont été réalisés indépendamment (Graphique 5). 108 _{bactéries ont été mises au contact de 100 µL d’une solution de} phages à 1010 _PFU.mL-1 _{soit 10}9 _{phages, ce qui équivaut à une MOI de 10. Après 10 min d’incubation, le tube} a été centrifugé permettant de recueillir le surnageant qui a été titré à 2.108 _{PFU /100 µL de calculer le} pourcentage de phages fixés à la surface des cellules

:

((1.10

-2.10

) /1.10

)*100 = 80 %

Graphique 6 : « One step growth curve » pour les phages Luz7 en présence de la souche PAO1 Période de latence

« Burst size »

Latence « Burst size » Graphique 5 : « One step growth curve » pour les phages 14.1 en présence de la souche PAO1

« Burst size »

128 Le culot contenant les phages et bactéries en interaction, a ensuite été remis en suspension dans 10 mL de milieu LB à 30 °C et en agitation à 120 rpm avec des prélèvements toutes les 10 min. Le tracé du titre des phages (en PFU.mL-1_{) en fonction du temps a permis d’estimer la période de latence de 20 à 25 min et le nombre} de virions libérés par cellule infectée à 70 PFU (Tableau 22). Les phages 14.1 sont décrits dans la littérature comme appartenant à la famille des Myoviridae type PB1. Le phage PB1 de P. aeruginosa a été décrit pour la première fois il y a près d'un demi-siècle (Holloway et al, 1960). Pas moins de 42 phages ont été rapportés comme étant de type PB1, principalement sur la base d’études génomiques et morphologiques. Récemment, le phage SL1 (Latz et al., 2017) a été isolé des eaux usées d’un hôpital. L’analyse de son génome a révélé qu’il appartient à la même famille que 14.1 avec 96 % d’homologie de séquence. Son cycle de réplication a été caractérisé par une période de latence de 45 min ainsi qu’un nombre de virions libérés par cellule d’environ 100 PFU (Latz et al., 2017). Cependant, contrairement à notre étude, la courbe de multiplication de SL1 a été réalisée à 37 °C en présence d’une souche de P. aeruginosa clinique multi-résistante (MDR-PA1) et non de la souche PAO1, ce qui pourrait expliquer que le temps de latence soit 20 à 25 min plus long. En effet, durant cette phase les phages doivent parvenir à injecter leur génome viral en franchissant la paroi bactérienne, hors si PAO1 est une souche sensible, d’autres souches devenues résistantes à certains antibiotiques sont susceptibles d’avoir évoluées par modification des protéines de surfaces, par exemple, ce qui pourrait interférer sur les interactions phages/ bactéries et retarder la lyse de l’hôte bactérien.

Dans le cas des phages LUZ7, les deux essais réalisés à des temps différents ont mis en évidence l’influence de la MOI sur la multiplication des phages (Graphique 6). Si le temps de latence reste le même, on remarque que la phase logarithmique est plus longue de 10 min dans le cas de la MOI 0,1 ce qui rallonge la durée totale du cycle de réplication. Néanmoins, ces deux expériences ont permis de déterminer et confirmer le nombre de virions libérés par cellules entre 160 et 167 (Tableau 22). Dans la littérature, l’étude de Ceyssens et

al, 2010 (Ceyssens et al., 2010) vise à caractériser trois phages de Pseudomonas génétiquement proches, dont

LUZ7, appartenant à la famille des Podoviridae. Ces auteurs supposent que les analogies de séquence entre ces trois phages sont probablement responsables de comportements identiques d’infection et analysent les phages Pev2. Ils montrent au travers de leurs essais de multiplication que pour Pev2, le cycle de réplication réalisé à 37 °C en TBS débute par une phase de latence de 20 min suivie d’une lyse de l’hôte dans les 25-30 min libérant entre 100 et 150 virions par cellules hôtes. Dans nos essais, la phase de latence réduite à 10 min peut s’expliquer par des différences de conditions expérimentales (30 °C vs 37 °C) mais également du protocole dont les détails ne figurent pas dans l’article.

129 Graphique 7 : « One step growth curve » pour les phages B1 en présence de la souche PAO1

L’ajout de phages B1 dans des proportions équivalentes au nombre de bactéries (MOI 1) a permis d’estimer au cours de deux essais la phase de latence entre 20 min et 25 min et le nombre de virions relargués entre 79 et 90 par cycle (Graphique 7 et Tableau 22).

Tableau 22 : Paramètres de lyse des phages 14.1, LUZ7 et B1.