P le nombre d'atomes dans un cristallite (2 atomes par maille)

Até meados dos anos 90 não havia um teste preciso para o diagnóstico da SXF. O recurso à análise citogenética dos “sítios frágeis” não permitia, por exemplo, identificar os casos de portadores da pré-mutação nem da mutação completa, do sexo feminino. Assim, a análise citogenética não é utilizada como método de diagnóstico para a SXF (Maddalena, 2001), uma vez que não oferece sensibilidade nem especificidade adequadas. Após a identificação do gene FMR1 em 1991 (Verkerk, 1991), foi possível desenvolver um teste de diagnóstico molecular que permite identificar 99% dos casos com SXF. A análise molecular do gene FMR1 é realizada numa amostra de sangue, podendo também ser efetuada noutros tecidos, como por exemplo, nas células de líquido amniótico e vilosidades coriónicas para o diagnóstico pré-natal. A realização do diagnóstico da SXF também é possível recorrendo à determinação da concentração da FMRP em diversos tecidos, como por exemplo a raiz de cabelo (Schutzius, 2013).

A maioria dos laboratórios recorre a duas metodologias distintas para a análise molecular do gene FMR1. Uma baseada na amplificação enzimática,

26 O mesmo que glóbulos brancos, células sanguíneas frequentemente utilizadas para a extração de dnA.

reação de polimerização em cadeia - PCR28_{, para quantificar o número}

exato de repetições CGG em situações normais e pequenas pré-mutações. Esta técnica é rápida e pode realizar-se com pequenas quantidades de DNA. No entanto, e devido às características peculiares desta região, para a caracterização de alelos de maior tamanho, é necessário recorrer a condições especiais para conseguir amplifica-la com sucesso e de forma reprodutível. Têm vindo a ser desenvolvidas algumas alternativas, baseadas em PCR, para amplificar os alelos expandidos (Chen, 2010; Filipovic-Sadic, 2010). A transição destas metodologias do plano investigacional para o diagnóstico representará um avanço para a rotina da análise do FMR1 e permitirá a sua aplicação em rastreios de larga escala. A outra tecnologia designa-se por Southern blot (apelidada com o nome do seu criador o Professor Sir Edwin Southern), e permite não só obter um valor aproximado do número das repetições qualquer que seja o seu tamanho, bem como determinar o estado de metilação do gene FMR1 quando utilizada em simultâneo com uma endonuclease sensível à metilação. Assim, o diagnóstico da SXF deve ser realizado por Southern blot que, para além de caracterizar a mutação completa permite também identificar os casos de mosaicismo de tamanho e/ou de metilação.

Amplificação do alelo 7.1. FMR1

A identificação de alelos de tamanho normal e pequenas pré-mutações é, no nosso laboratório29_{, realizada partindo de uma mistura de PCR}

convencional suplementada com betaína, dimetilsulfóxido, uma polimerase30

e os primers31 _{que reconhecem sequências adjacentes à região repetitiva}

(Jorge, 2013). A amplificação é efetuada, num termociclador, em 3 passos que se repetem 40 vezes. após uma desnaturação inicial durante 10 minutos a 95°C, cada um dos 40 ciclos consiste em 45 segundos a 98°C, 45 segundos a 58°C e 2 minutos a 68°C. No final seguem-se 10 minutos adicionais a 68°C.

The gold standard: Southern blotting 7.2.

A genotipagem por Southern blot exige uma quantidade de DNA inicial muito superior à necessária para a reação de PCR e demora vários dias até à obtenção do resultado final. Resumidamente, esta metodologia inicia-se pela fragmentação da amostra através da ação de enzimas de restrição (figura 5). Os fragmentos resultantes são posteriormente separados, de acordo com o seu tamanho, numa eletroforese em gel de agarose (os mais pequenos migram para zonas mais distantes do ponto de aplicação). No protocolo mais vulgarmente utilizado para a análise do gene FMR1 recorre-se à dupla digestão com as enzimas de restrição, EcoRI e EagI (Jacquemont, 2011).

28 em inglês, polymerase chain reaction.

29 Centro de genética médica doutor Jacinto de magalhães, CHP, Porto, http://www. chporto.pt/.

30 sigma-AccuTaq™ lA dnA Polymerase. 31 Oligonucleótidos iniciadores.

Figura 4 – Resultados da amplificação da região repetitiva do gene fmr1 utilizando primers

fluorescentes32_{, após eletroforese capilar no analisador automático ABI 3130xl Genetic Analyzer}

e análise recorrendo ao software GeneMapper® versão 4.0. no eixo do Y está representada a intensidade de fluorescência e no eixo do X o tamanho do produto amplificado em pares de bases (bp). (A) Padrão de tamanho33_{, sendo visíveis os fragmentos correspondentes a 200, ~250,}

300, 340, 350, 400, 450, 490 e 500 bp. (B) individuo do sexo feminino heterozigótico para alelos de 19 e 29 Cgg. (C) indivíduo do sexo masculino hemizigoto para um alelo de 19 Cgg. (d) indivíduo do sexo masculino portador de uma pré-mutação com cerca de 85 Cgg. (e) indivíduo do sexo masculino com mutação completa (revelando ausência de amplificação do alelo fmr1 de tamanho normal). Imagens obtidas na Unidade de Genética Molecular do Centro de Genética médica doutor Jacinto de magalhães.

Figura 5 – Esquema com a identificação dos locais de corte, de reconhecimento da sonda e

tamanho dos fragmentos originados pelas enzimas de restrição, ecori e eagi, utilizadas na análise por Southern blot. A digestão com a endonuclease ecori origina fragmentos de 5.2 kb (2800 + 2400 bp). A segunda endonuclease, EagI, é sensível à metilação (*), o que significa que não reconhece e não digere o dnA metilado, originando um fragmento de 2.8 kb quando o dnA não está metilado. mapa de restrição e restantes informações obtidas de http://genome.ucsc.edu/.

32 marcados 6-fAm™. 33 genescan™ 500 rOx™.

A multiplicidade dos fragmentos gerados após a digestão enzimática é observada sob a forma de um smear (arrastamento) (figura 6 – A). A etapa seguinte consiste na transferência destes para uma membrana com capacidade de ligar DNA (Southern blotting), seguindo-se de uma reação de hibridação34 _{com uma sonda de cadeia simples. A sonda deve ser marcada}

com uma molécula que permita a sua posterior deteção, por exemplo a digoxigenina – DIG (figura 6 – B) (Gold, 2000; Macpherson, 2005). Uma amostra de DNA de um indivíduo, do sexo feminino, com alelos de tamanho normal, revela dois fragmentos correspondentes a 2.8 e 5.2 kb, refletindo respetivamente o cromossoma X ativo (não metilado) e o inativo (metilado). O tamanho do fragmento de DNA contendo uma pré- mutação está geralmente aumentado cerca de 150 a 500 bp originando fragmentos de cerca de 2.9-3.2 kb (X ativo) e aproximadamente 5.3-5.7 kb (X inativo). Um portador de uma pré-mutação, do sexo masculino, apresenta ausência do fragmento com 2.8 kb, sendo visível um outro que migra de forma mais lenta, com tamanho superior a 2.8 kb. Nas amostras de indivíduos com mutação completa, o fragmento de tamanho normal é substituído por vários fragmentos de tamanho definido ou um arrastamento de fragmentos de elevado peso molecular, que representam a instabilidade somática da mutação (mosaicismo), e cujo tamanho pode variar entre os 5.8 e os 9 kb (contendo mais de 200 e até 1000 CGG). As mulheres portadoras da mutação completa, com ou sem fenótipo, apresentam para além destes fragmentos mutados, os fragmentos de tamanho normal, representativos do cromossoma X ativo e inativo, devido à aleatoriedade da inativação do cromossoma X25_.

Rastreios familiares e populacionais