Nous avons pu observer une réduction de l’OxHm - composé naturellement présent en faible proportion dans le sang humain - sous contraintes de cisaillement, que nous avons corrélée à l’augmentation de la transcription de HO-1 par les HUVEC. Le flux laminaire appliqué aux HUVEC, combiné à la présence d’HBOC, est donc responsable de l’activation d’un processus de protection des cellules endothéliales face à l’OxHm basé, entre autres, sur l’HO-1. De plus, la présence de metHb est connue pour induire l’activation de la transcription de HO-1. Les proportions de metHb, dans les cultures sous contraintes de cisaillement, sont équivalentes pour l’Hb-Dex-BTC et l’Oxyglobin®. L’induction de la transcription de HO-1 étant plus forte pour l’Oxyglobin® que pour l’Hb-Dex-BTC, nous avons supposé que ce mécanisme se rapportait à la concentration d’OxHm dans le milieu. Donc, au-delà de la concentration en metHb contenue dans les solutions injectables, le stress oxydatif observé dans de nombreuses études in vivo (Alayash, 2001), pourrait être interprété en terme de concentration en OxHm. L’induction de HO-1 par de faibles concentrations d’hème a un effet anti-inflammatoire et cyto-protecteur (Hayashi et al., 1999) par la stimulation de la formation de CO et de biliverdine, produits de dégradation de l’hème par HO-1. Cependant, une forte concentration d’hème est délétère pour les tissus, par ses actions pro-oxydante et inflammatoire (Nath et al., 2001 ; Wagener et al., 2001). Ces actions ne peuvent pas être neutralisées par les propriétés anti-oxydantes et anti-inflammatoires des produits de dégradation de l’hème par HO-1. Dans notre étude, les concentrations d’Hb-Dex-BTC et d’Oxyglobin® sont les mêmes ; cependant, elle n’induisent pas HO-1de la même façon. Cette situation pourrait provoquer une réponse différente des cellules endothéliales au niveau inflammatoire. Après 4 h d’hypoxie, suivies d’une heure de réoxygénation, l’Oxyglobin® induit une augmentation de lactate, H2O2 et de son taux de metHb comparé à l’Hb-Dex-BTC et à l’ -Hb. La transcription d’HO-1 est augmentée à la fois par l’Oxyglobin® et l’ -Hb. Les résultats, après 24 h d’hypoxie, montrent une augmentation d’H2O2 en présence d’Oxyglobin®, alors que le taux de metHb ne varie pas. La production de metHb n’est donc pas corrélée à celle d’H2O2. De plus, l’Oxyglobin® induit une élévation du taux de transcription d’HO-1. Donc celle-ci ne semble pas corrélée, dans notre système, au taux de metHb. En rapprochant les résultats après 4 et 24 h d’hypoxie, on peut penser que l’induction de la transcription de HO-1 est engendrée par la production massive d’H2O2 par les cellules endothéliales en présence d’Oxyglobin®. De toutes ces observations, nous avons conclu qu’il est nécessaire de maintenir le taux de metHb en dessous de 10%, seuil maximum de tolérance de l’organisme. Cependant, nous avons montré qu’il était d’autant plus important de mesurer les taux d’OxHm contenus dans les solutions d’HBOC afin de prévoir le stress oxydatif potentiel appliqué, in vivo, aux cellules endothéliales lors de la reperfusion. II. Evaluation de l’inflammation : L’étude de l’inflammation, induite par la présence d’HBOC au contact des cellules endothéliales cultivées sous contraintes de cisaillement, a montré que ICAM-1 n’est pas influencée par la présence d’HBOC, mais seulement pas le flux laminaire, ceci tant au niveau transcriptionnel, qu’au niveau de son expression membranaire. La E-sélectine paraît plus sensible à la présence d’HBOC associée aux contraintes de cisaillement. En effet, la transcription de la E-sélectine est augmentée par la présence d’Oxyglobin® et de contraintes de cisaillement, alors que la même culture en présence d’Hb-Dex-BTC, la réprime. Précédemment, nous avons montré que l’induction de la transcription de HO-1 était plus forte pour l’Oxyglobin® que pour l’Hb-Dex-BTC. Donc la répression de la transcription de la E-sélectine ne peut être associée à l’effet anti-inflammatoire du CO et de la biliverdine. Une autre hypothèse concernant la présence de dextran peut être avancée et sera développée ultérieurement. Si nous considérons maintenant l’expression de la protéine au niveau membranaire, nous constatons que la diminution du nombre de sites de E-sélectine sous flux laminaire est effective pour les deux HBOC testés. Celle-ci peut être engendrée par une diminution de son expression au niveau de la membrane, ou à un relargage de la forme soluble de la E-sélectine dans le milieu (Pigott et al., 1992). Pour la levée d’hypoxie, tous les HBOC étudiés induisent une augmentation de la transcription d’ICAM-1 et d’E-sélectine, après 4 h d’hypoxie, avec un effet plus faible en ce qui concerne l’Hb-Dex-BTC. L’étude de l’expression membranaire de ces protéines montre que seule l’Hb-Dex-BTC réduit le nombre de sites de la E-sélectine, comparé aux autres HBOC. Après 24 h d’hypoxie, l’Oxyglobin® induit la transcription d’ICAM-1 et de la E-sélectine, alors que l’Hb-Dex-BTC est impliquée dans celle d’ICAM-1 et augmente l’expression membranaire d’ICAM-1 et d’E-sélectine. Après 4 ou 24 h d’hypoxie, la réoxygénation en présence d’HBOC induit une inflammation qui est cependant plus intense après 24 h qu’après 4h. D’une manière générale, la réoxygénation après 4 ou 24 h d’hypoxie avec l’Hb-Dex-BTC ou l’ -Hb semble mieux tolérée par la cellule endothéliale qu’en présence d’Oxyglobin®. Ceci montre combien les modifications chimiques apportées à l’hémoglobine, ainsi que sa provenance, pourraient influencer le comportement des cellules endothéliales, et donc des vaisseaux. Deux informations importantes ressortent de ces études. Tout d’abord, l’utilisation de dextran dans la formulation de l’Hb-Dex-BTC semblerait diminuer l’inflammation engendrée par la présence d’hémoglobine libre au contact des cellules endothéliales. En effet, le dextran rendrait furtives les molécules et ne s’exprimerait que sous contraintes de cisaillement(Ley et al., 1989). Cette étude a mis en évidence une diminution de l’adhésion de polynucléaires neutrophiles aux cellules endothéliales, en présence de dextran et proportionnellement aux contraintes de cisaillement appliquées (maximum de 70% à 1 Pa). Notre étude permettrait d’aller plus loin dans cette observation en supposant que le dextran réprimerait, par un mécanisme inconnu, la transcription de la E-sélectine, uniquement sous contraintes de Dans le document Relations cellules endothéliales/substituts sanguins : implication des contraintes de cisaillement ou de l'hypoxie, et évaluation de la cytotoxicité d'hémoglobines de nouvelle génération (Page 171-174)
