Les outils de modélisation structurels

5.1. Análise da microbiota intestinal

Na análise microbiológica realizada no intestino dos peixes alimentados com as dietas suplementadas com diferentes níveis de mananoligossacarídeo, a porcentagem de enterobactérias foi menor que no grupo controle (p<0,05). Essa redução na porcentagem de enterobactérias foi mais acentuada nos maiores níveis de suplementação (8, 10 e 15 g kg-1_{) após 45 dias. Os peixes alimentados com a}

ração contendo 10 g kg-1 _{apresentaram a menor porcentagem de enterobactérias no}

intestino (p<0,05) (Tabela 3) evidenciando a ação benéfica do prebiótico na colonização intestinal, uma vez que este modificou essa microbiota e impediu a colonização de bactérias patogênicas no intestino.

Embora a microbiota presente no intestino dos peixes já tenha sido identificada em alguns trabalhos (DANIELS et al., 2010; GREEN; SMULLEN;

BARNES, 2013; WU et al., 2013), pouco se conhece sobre a comunidade bacteriana e seu estabelecimento no intestino, sua diversidade e seu papel na nutrição e na saúde dos peixes (NAYAK, 2010).

A redução de enterobactérias associada à alimentação com mananoligossacarídeo foi observada em outros trabalhos (WU et al., 2013) e a não redução também (ALAK; HISAR, 2012).

Tabela 3. Porcentagem de Enterobactérias no intestino médio da tilápia-do-nilo

(Oreochromis niloticus) alimentadas com dietas suplementadas com diferentes níveis de mananoligossacarídeo (MOS).

Tempo MOS (g kg -1₎ Significância 0 2 4 8 10 15 0 0,62 1,45 0,320 4,88 3,93 4,93 ns 7 32,65 1,36 3,44 4,30 3,55 3,73 * 15 27,95 2,88 3,14 2,99 1,54 3,55 * 30 21,80 3,91 2,59 2,24 0,55 2,12 * 45 25,63 5,62 1,97 1,77 0,34 1,50 * Significância * * ns * * *

* = significativo (p<0,05); ns = não significativo (p>0,05).

A porcentagem total de bactérias aeróbias (Tabela 4) foi significativamente menor (p<0,05) em todos os níveis de suplementação com mananoligossacarídeo quando comparado ao grupo controle. A partir de sete dias de alimentação com o prebiótico (todos os níveis) a porcentagem de bactérias aeróbias foi reduzida no intestino das tilápias ao longo do tempo e a menor quantidade de bactérias foi observada no nível 8 g kg-1 (0,37%) após 45 dias de alimentação, seguido do grupo alimentado com 15 g kg-1 (0,54%). A redução dessas bactérias no intestino dos peixes é muito importante, uma vez que a maioria das bactérias que causam doenças nas tilápias são bactérias aeróbias gram negativas. Em experimento realizado com Oncorhynchus mykiss ocorreu redução das bactérias totais e

Aeromonas sp. nos peixes alimentados com dieta contendo 2 g Kg-1 de

mananoligossacarídeo durante 58 dias (DIMITROGLOU et al., 2009). Oreochromis

niloticus alimentada com uma dieta suplementada com Lactobacillus plantarum

demonstrou redução no número total de bactérias no intestino, em relação às tilápias alimentadas com dieta suplementada com Lactobacillus brevis, porém o número de bactéria totais no intestino dos peixes do grupo controle não diferiu de ambas bactérias ácido-lácticas (JATOBÁ et al., 2008).

Tabela 4. Porcentagem de bactérias aeróbias no intestino médio da tilápia-do-nilo

(Oreochromis niloticus) alimentadas com dietas suplementadas com diferentes níveis de mananoligossacarídeo (MOS).

Tempo MOS (g kg -1₎ Significância 0 2 4 8 10 15 0 5,21 4,63 5,21 2,35 4,24 9,30 * 7 5,50 4,59 4,40 1,47 3,48 7,42 * 15 3,97 2,97 3,52 0,53 3,33 3,81 * 30 3,96 2,56 3,13 0,43 2,18 2,12 * 45 3,91 1,62 1,74 0,37 1,66 0,54 * Significância ns * * * * * ns = não significativo (p>0,05).

A inclusão de mananoligossacarídeo na alimentação da tilápia-do-nilo, nos níveis maiores que 4 g kg-1 provocou um aumento (p<0,05) na porcentagem de bactérias anaeróbias no intestino dos peixes após sete dias de alimentação (Tabela 5), com o maior aumento na porcentagem dessas bactérias, sendo observada nos peixes alimentados com dieta suplementada com 15 g kg-1 após 45 dias (17,52%). O tempo de alimentação também foi significativamente diferente entre os diferentes níveis de suplementação e o grupo controle. A partir do sétimo dia de alimentação com as dietas suplementadas com níveis superiores a 4 g kg-1, a porcentagem de bactérias anaeróbias foi crescente no intestino dos peixes. Dados abordando a contagem de bactérias anaeróbias totais em peixes alimentados com mananoligossacarídeo são escassos, todavia, sabe-se que a colonização do

intestino, estabelecimento, composição e diversidade microbiana é reflexo da composição microbiana da água, dieta e ambiente (GELDREICH; CLARKE, 1966; BURAS et al., 1987; KORSNES et al., 2006; RING et al., 2006a; RING et al., 2006b; FJELLHEIM et al., 2007; NAYAK, 2010).

Tabela 5. Porcentagem de bactérias anaeróbias no intestino médio da tilápia-

do-nilo (Oreochromis niloticus) alimentadas com dietas suplementadas com diferentes níveis de mananoligossacarídeo (MOS).

Tempo MOS (g kg -1₎ Significância 0 2 4 8 10 15 0 0,99 5,69 1,87 1,03 1,86 1,73 * 7 0,91 4,19 2,37 3,84 2,75 5,10 * 15 0,43 1,83 3,35 4,19 3,56 5,67 * 30 1,76 2,55 4,22 4,80 5,14 8,02 * 45 1,79 3,18 6,37 5,64 5,93 17,52 * Significância * * * * * * * = significativo (p<0,05);

A redução das enterobactérias no intestino das tilápias, pela inclusão de mananoligossacarídeo na dieta pode ser explicada pela capacidade do prebiótico promover a adsorção de bactérias gram-negativas, principalmente as que contêm fímbria tipo I, pois, estas fímbrias ligam-se a D-manose que é constituinte do mananoligossacarídeo, evitando a adesão às vilosidades intestinais (FIRON; OFEK; SHARON, 1983; SPRING et al., 2000; FINUCANE; SPRING; NEWMAN, 1999).

Como demonstrado neste experimento, à inclusão dietética de mananoligossacarídeo reduziu a proliferação de enterobactérias e aumentou a porcentagem de bactérias anaeróbias totais no intestino da tilápia, o que contribui para prevenir doenças e melhorar a saúde do animal.

Com relação ao crescimento de bactérias do gênero Bacillus (Tabela 6), os peixes alimentados com as dietas suplementadas com diferentes níveis de mananoligossacarídeo apresentaram quantidade superiores de Bacillus sp. (p<0,05)

que os peixes do grupo controle colonizando o intestino após 30 dias de alimentação (p<0,05). A maior porcentagem desse grupo bacteriano foi encontrada nos peixes alimentados com dieta suplementada com 8 g kg-1 _{após 45 dias (12,60%). A menor}

porcentagem de Bacillus sp. foi encontrada nos peixes do grupo controle (p<0,05). Esse fato é muito importante, pois demonstra que as bactérias probióticas levam um tempo maior após receberem prebióticos para colonizar o intestino e realmente contribuir beneficamente na saúde do animal, indicando que essas bactérias benéficas podem exercer um papel no controle do estabelecimento de bactérias patogênicas no intestino da tilápia, principalmente de Aeromonas spp.,

Pseudomonas fluorescens, Vibrio anguillarum, Flavobacterium columnare,

Edwardsiella tarda, Streptococcus spp. e Enterococcus sp., frequentemente

encontradas no intestino dessa espécie e que causam enfermidades. Essa redução provavelmente ocorreu por exclusão competitiva por nutrientes e espaço entre as bactérias (GOMEZ-GIL; ROQUE; TURNBULL, 2000) ou pela produção de substâncias antimicrobianas pelos Bacillus sp. (CHERIF et al., 2001).

Psetta maxima alimentado com dieta suplementada com 2% de oligofrutose

durante 55 dias tiveram um aumento significativo de Bacillus sp. no intestino e este aumento ocorreu devido a alimentação com o prebiótico (MAHIOUS et al., 2006).

Na aquicultura, as bactérias Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis são mais comumente utilizadas como probióticos (TIMMERMAN et al., 2004), pois possuem características importantes como habilidade de adesão à parede intestinal, produção de bacteriocina (peptídeos antimicrobianos) e capacidade de aumentar a resposta imunológica dos peixes (BARBOSA et al., 2005; CHERIF et al., 2001; CLADERA- OLIVERA; CARON; BRANDELLI, 2004). A suplementação com esses probióticos na dieta de Oncorhynchus mykiss aumentou a taxa de crescimento, a eficiência na utilização do alimento, e, ainda, essas bactérias foram capazes de colonizar 80% do trato gastrointestinal da espécie (BAGUERI et al., 2008; MERRIFIELD, 2011).

Tabela 6. Porcentagem de Bacillus sp. no intestino médio de tilápia-do-nilo

(Oreochromis niloticus) alimentadas com dietas suplementadas com diferentes níveis de mananoligossacarídeo (MOS).

Tempo MOS (g kg -1₎ Significância 0 2 4 8 10 15 0 0,52 2,07 1,21 1,30 1,42 2,17 * 7 0,57 3,90 3,06 1,65 1,85 2,48 * 15 0,56 4,35 3,54 4,38 3,58 4,26 * 30 1,28 4,53 5,22 8,25 3,77 7,19 * 45 1,04 6,87 7,41 12,60 4,10 7,37 * Significância * * * * * * * = significativo (p<0,05);

Com relação à identificação molecular das bactérias isoladas do intestino médio das tilápias alimentadas com dieta suplementada com mananoligossacarídeo e das tilápias que não receberam o prebiótico, foram caracterizadas as principais bactérias que colonizam o intestino desta espécie (Tabela 7), Aeromonas veronii,

Edwardsiella tarda, Edwardsiella hoshinae, Plesiomonas shigelloides e Salmonella

Typhimurium, todas patogênicas para a espécie e também para humanos. Com

relação às bactérias probióticas, cinco gêneros foram isolados: Bacillus cereus,

Bacillus subtilis subsp inaquosorum, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis e

Brevibacillus agri.

Os resultados obtidos nesse estudo são relevantes, pois o aumento de bactérias consideradas probióticas melhora consideravelmente a saúde intestinal dos peixes e consequentemente o seu sistema imunológico, uma vez que competem com as bactérias patogênicas por espaço e alimento e, favorecidas pela suplementação com mananoligossacarídeo se multiplicam e crescem mais rápido eliminando as bactérias indesejáveis. Isso faz com que os peixes sejam mais resistentes às enfermidades e suportem mais as condições estressantes de manejo impostas durante todo o período de criação.

Tabela 7. Identificação molecular por meio de sequenciamento do gene 16S rDNA

de isolados bacterianos provenientes do intestino médio da tilápia-do-nilo

(Oreochromis niloticus) alimentadas e não alimentadas com dieta

suplementada com mananoligossacarídeo (MOS).

Identificação Acesso

Aeromonas veronii NR_102789.1

Bacillus cereus NR_074540.1

Bacillus subtilis subsp inaquosorum NR_104873.1

Bacillus subtilis subsp subitilis NR_102783.1

Bacillus licheniformis NR_074923.1 Brevibacillus agri NR_040983.1 Edwardsiella tarda NR_102813.1 Edwardsiella hoshinae NR_024768.1 Klebsiella oxytoca NR_102982.1 Plesiomonas shigelloides NR_044827.1

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium NR_074910.1

5.2. Morfometria das vilosidades intestinais

Com relação a histologia do intestino das tilápias alimentadas durante sete

dias com dieta suplementada com mananoligossacarídeo as medidas dos microvilos (largura, altura e altura total das vilosidades) foram superiores nos peixes alimentados com 10 g Kg-1 de mananoligossacarídeo (Tabela 8) quando comparados ao grupo controle e aos demais níveis de suplementação (p>0,05). Já a maior espessura das vilosidades foi observada nos peixes alimentados com a dieta suplementada com 8 g Kg-1 no mesmo período de alimentação (sete dias).

Tabela 8. Morfometria do intestino médio da tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus)

após suplementação alimentar com mananoligossacarídeo (MOS) e ração controle.

Período

Parâmetro MOS (g kg-1) Dia 0 7 Dias 15 Dias 30 Dias 45 Dias

LV1 Controle 16,05±2,04ab 18,66±1,45ab 15,56±2,70 15,38±1,39 14,33±3,32c 2 16,45± 0,56ab _16,45±1,51b _{18,95±1,42 15,15±1,93 19,82±2,72}ab 4 14,42±1,89b 17,51±2,95ab 16,37±1,60 16,34±1,45 16,24±1,15bc 8 15,79±1,42ab 18,91±4,51ab 14,71±3,52 18,59±1,34 23,46±5,87a 10 19,49± 2,25a _22,04±3,50a _{16,98±3,45 18,28±0,63 17,81±3,46}bc 15 14,96±1,98ab 18,46±0,00ab 14,39±1,22 16,93±3,13 16,55±1,91bc AV2 Controle 27,50±0,94b 30,64±4,37ab 32,30±2,16 34,62±3,62 34,82±5,49 2 56,77±15,48a 35,77±4,32ab 32,05±6,11 30,72 ±8,19 34,79±7,11 4 30,61±3,34b 33,13±2,09ab 30,47±1,03 32,91±5,85 35,39±4,19 8 37,90±23,65b 24,09±6,67b 31,60±4,12 36,68±4,13 42,36±6,89 10 28,76±2,08b _38,34±4,87a _{27,10±5,57 36,37±1,25 33,56±6,80} 15 30,34±4,31b _34,57±0,00ab _{29,25±3,11 32,84±3,39 33,77±1,55} ATV3 Controle 36,91±1,25b _43,50±6,30ab _{46,95±2,98 47,57±2,85 49,01±4,21} 2 74,22±13,86a 45,73±8,21ab 45,98±4,06 44,04±11,03 54,12±10,76 4 41,64±6,10b 46,43±2,80ab 42,56±1,35 48,19±8,35 48,51±5,09 8 48,39±26,73b _34,09±11,71b _{45,85±1,69 51,09±4,83 60,34 ± 9,07} 10 38,20±2,56b 55,11±6,19a 37,82±8,99 53,07±4,70 48,68±9,39 15 40,89 ±5,09b _45,66±0,00ab _{44,94±3,04 48,69±2,97 47,60±0,93} EV4 Controle 5,69±0,31ab _6,58±0,10ab _{5,98±0,80 6,11±0,70 5,55±1,09} 2 6,63±0,64a 5,67±0,41b 6,50±0,70 6,19±0,74 6,27±0,66 4 5,25±0,66b _6,30±0,66ab _{6,44±0,80 5,88±0,57 6,04±0,77} 8 6,07±0,40ab _7,58±0,01a _{5,72±0,47 7,06±1,14 6,59±1,53} 10 6,95±0,96a 6,55±0,88ab 5,65±0,27 6,14±0,30 6,23±1,33 15 5,63±0,64ab _5,99±0,00b _{5,63±0,64 5,86±0,42 6,30±0,71} CC5 Controle 2,47±0,02 1,98±0,25a _{1,74±0,40 1,32±0,18 1,36±0,33} 2 2,39±0,22 1,56±0,24ab 1,82±0,22 1,67±0,14 1,51±0,12 4 2,40±0,34 1,75±0,55a _{1,41±0,20 1,53±0,30 1,42±0,34} 8 2,10±0,26 1,11±0,00b 1,88±0.26 1,70±0,00 1,16±0,15 10 2,01±0,17 1,95±0,25a 1,88±0,74 1,81±0,17 1,34±0,44 15 2,36±0,29 1,80±0,00a _{1,66±0,35 1,79±0,19 1,48±0,34}

1_{LV: Largura das Vilosidades (µm);} 2_{AV: Altura das Vilosidades (µm);} 3_{ATV: Altura}

Total das Vilosidades (µm); 4EV: Espessura das Vilosidades (µm); 5CC: Células Caliciformes.

Esse aumento provocado pela suplementação com mananoligossacarídeo nos vilos é muito importante, uma vez que o desenvolvimento da mucosa intestinal consiste no aumento da altura e densidade dos vilos, pelo aumento no número das células epiteliais (enterócitos, células caliciformes e enteroendócrinas). Isso contribui para aumentar a área de superfície para a digestão e absorção intestinal, garantindo maior ganho de peso para o animal.

Oreochromis niloticus alimentadas com dieta suplementada com 2 g Kg-1 de

mananoligossacarídeo demonstraram aumento da altura dos vilos, sugerindo que o prebiótico aumenta a capacidade de absorção do animal (ABU-ELALA; MARZOU; MOUSTAFA, 2013). O mesmo foi observado em Dicentrarchus labrax alimentado durante 60 dias com uma dieta suplementada com 4 g kg-1 de mananoligossacarídeo (TORRECILLAS et al., 2013), em larvas de Homarus gammarus L alimentadas com dieta suplementada com Bacillus (100 mg l−1), MOS (12 mg l−1) e Bacillus (100 mg l−1) + MOS (12 mg l−1) durante 30 dias (DANIELS et al., 2010), Sciaenops ocellatus alimentados com dieta suplementada com 1 g kg-1 de mananoligossacarídeo durante oito semanas (ZHOU; BUENTELLO; GATLIN III, 2010) e em Litopenaeus vannamei alimentados durante oito semanas com dieta suplementada com 2 g kg-1 de mananoligossacarídeo (ZHANG et al., 2012).

Em larva de Rachycentron canadum alimentadas com dieta suplementada com 2 g Kg-1 _{de mananoligossacarídeo, durante 14 dias, foi observado aumento no}

comprimento dos microvilos, sugerindo que o mananoligossacarídeo protege o intestino bloqueando a adesão de bactérias patogênicas, modificando a microbiota intestinal e aumentando a disponibilidade dos nutrientes (GOMEZ-GIL; ROQUE; TURNBULL, 2000; SPRING et al., 2000). Todavia, uma alimentação com dieta suplementada com mananoligossacarídeo (2 g Kg-1_{) para juvenis e adultos de}

Oncorhynchus mykiss, durante 111 e 58 dias, respectivamente (DIMITROGLOU et

al., 2009), para Sparus aurata (2 e 4 g kg-1 _{de MOS) durante nove semanas}

(DIMITROGLOU et al., 2010b) e para larvas de Diplodus sargus L (2 g kg-1 _{de MOS)}

durante 43 dias (DIMITROGLOU et al., 2010a) não provocou alterações significativas na morfologia do intestino dos peixes que receberam o prebiótico quando comparados ao grupo controle.

vilosidades (Figura 1), com aumento destas em todos os níveis de suplementação com mananoligossacarídeo a partir de sete dias do fornecimento das dietas, com número maior dessas células presentes no intestino dos peixes alimentados com 10 g Kg-1 _{do prebiótico. Essas células são as responsáveis pela secreção de}

glicoproteínas (muco), o qual fornece uma eficiente barreira física e imunológica contra microrganismos e substâncias externas, além de ser responsável pela lubrificação e transporte intestinal (VAN KLINKEN et al., 1995; ZHU et al., 2012). O aumento dessas células no intestino dos peixes alimentados com o prebiótico é muito importante uma vez que a mucosa intestinal estará protegida do ataque de bactérias indesejáveis.

Figura 1. Corte transversal do intestino médio da tilápia-do-nilo (Oreochromis

niloticus) alimentada durante 45 dias com dieta suplementada com

mananoligossacarídeo (MOS) e ração controle mostrando as vilosidades intestinais. A: Controle; B: 2 g Kg-1; C: 4 g kg-1; D: 8 g Kg-1; E: 10 g Kg-1; F: 15 g Kg-1. Figura (A) - L: Largura, A: Altura, AT: Altura Total, E: Espessura; Figura (D) - CC: Células Caliciformes. Coloração H&E (10x).

10 µm 10 µm E A AT L

A

D

10 µm CC

B

10 µm

C

F

E

10 µm 10 µm

6. CONCLUSÃO

A adição de mananoligossacarídeo à dieta de Oreochromis niloticus, a partir do nível de inclusão 2 g kg-1 é capaz de diminuir a população de bactérias patogênicas após 30 dias de alimentação e aumentar a população de bactérias benéficas, o que pode refletir na integridade intestinal e saúde dos peixes.

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