Outils génétiques et génomiques disponibles

M. truncatula, avec un petit génome approximativement de 500 Mbp, a été largement

acceptée comme plante modèle pour des aspects multiples de la génétique de légumineuse et de génomique (Cook 1999).

Plusieurs projets à grande échelle sur la génomique de M. truncatula ont été lancés par la communauté internationale et des outils essentiels sont développés pour la génomique structurale et fonctionnelle suite au développement des ressources bioinformatiques (Frugoli et Harris 2001).

Introduction

L’analyse génétique d’un organisme exige la mise en œuvre de méthodes et techniques diverses qui vont permettre d’ordonner les gènes, de les localiser sur le génome et enfin de les cloner. La création de cartes génétiques et génomiques est donc indispensable. En outre, l’analyse comparative de ces cartes d’organismes différents permet d’étudier l’évolution de leurs génomes (Zhu et al. 2005).

Nous allons dire quelques mots sur les différents outils indispensables pour l’analyse des génomes.

II.6.1. Microsatellites

Parmi les marqueurs possibles disponibles, les microsatellites sont généralement utilisés pour de nombreux projets génétiques en raison de leur grande reproductibilité et de la facilité d’identifier des allèles.

Les microsatellites sont des séquences d'ADN répétées en tandem dont l'unité de répétitions varie d’une à six pb. Dans la littérature, on les appelle aussi: simple sequence repeats (SSR), short tandem repeats (STR), ou variable number tandem repeats (VNTR).

Les principales contraintes des SSRs, en tant que marqueurs moléculaires, sont l’effort et le coût exigé pour leur développement. Pour cette raison leur utilisation a été limitée à quelques espèces importantes sur le plan agricole.

La recherche des SSRs a été récemment centrée sur les EST (Expressed Sequence Tag) - SSRs, qui sont relativement peu coûteux comparés au développement de SSRs génomiques (Gupta et al. 2003) puisqu’ils sont identifiés dans des séquences nucléotidiques. Ces marqueurs sont plus transmissibles aux genres étroitement liés puisqu'ils sont ancrés dans des régions conservées transcrites (Decroocq et al. 2003).

II.6. 2. Microarrays et analyse du transcriptome

Chez M. truncatula, environ 190.000 ESTs (May et Dixon 2004; Young et al. 2005) (www.medicago.org/MtDB2/ et www.tigr.org/tdb/tgi/plant.shtml) avec les microarray et les puces à ADN correspondantes, ont été produites. Les tissus sources de ces ESTs incluent les tissus de base des tiges et des racines, ainsi que des tissus activés, lors de symbiose rhizobiales et mycorhiziennes et lors des résistances aux maladies ou les poils absorbants racinaires (Covitz et al. 1998; Cook 1999).

L’assemblage (clustering) des EST permet de connaître la séquence complète de l’ADNc. On peut donc choisir parmi l’ensemble des gènes représentés le meilleur clone ADNc pour mettre sur le micro-réseau (microarray).

Un consortium NSF travaille à la construction d’une collection non redondante et universelle d’ADNc comportant au départ 6 000 gènes et qui représentera à terme tous les gènes transcrits de M. truncatula (estimés à 20-30 000) et sera accessible à la communauté sous la forme de clones individuels et de microarrays.

II.6.3. Collections de variants naturels et de mutants

Une collection représentative de la variabilité génétique naturelle, ainsi qu'une collection de mutants induits chez M. truncatula, représentent un pilier important et stratégique pour les actions d'analyse génomique, de validation de gènes candidats, et d'innovation végétale. Pour Mtr, la collection de lignées est gérée à l’INRA de Montpellier et celle de mutants est gérée à l’INRA de Dijon (Unité de Recherches en Génétique et Ecophysiologie des Légumineuses à Graines).

Plusieurs programmes de mutagenèse par des agents physico-chimiques classiques ont été réalisés: par rayons γ (Sagan et al. 1995), par l’EMS (Penmetsa et Cook 2000). Ils ont fourni le matériel nécessaire pour des criblages à grande échelle sur divers phénotypes, et en premier lieu pour des mutants affectés dans les interactions symbiotiques fixatrices d’azote et/ou mycorhizienne.

II.6.4. Mutagenèse insertionelle

La mutagenèse insertionnelle permet de créer des mutants en insérant au hasard, dans le génome, un segment d’ADN repérable (ADN-T ou transposons). Lorsque celui-ci s’intègre dans un gène, il en altère la fonction et provoque la modification du caractère correspondant donc une mutation. Le gène muté est localisé grâce à l’élément inséré, et sa fonction est identifiée grâce au caractère affecté. Cette stratégie a déjà fait preuve de son efficacité chez A.

thaliana pour la génétique directe ou inverse (Parinov et Sundaresan 2000). Elle a permis de

construire plusieurs collections de plus de 50 000 lignées d’insertion d’ADN-T (Bent 2000). Chez M. truncatula, des Systèmes knock-out impliquant ADN-T et Tnt1 (retrotransposon du tabac) (d’Erfurth et al. 2003), et gene Tilling (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) sont en cours de développement. A l’INRA de Dijon, un projet de TILLING chez M. truncatula a été financé par le projet FP6 “Grain Legumes”.

II.6.5. Cartes génétiques, physique et cytogénétique

Les cartes génétiques reposent sur l'évaluation de la distance relative séparant des caractères héréditaires ou marqueurs génétiques. La distance génétique entre deux gènes se

Introduction

définit par la fréquence d'apparition d'événements de recombinaisons entre ces gènes d'une génération à l'autre. Cette fréquence de recombinaison constitue l'unité de mesure des cartes génétiques, 1% de recombinaison correspondant approximativement à une distance de 1 centi-

Morgan.

Des cartes génétiques comprenant plusieurs centaines de marqueurs ont été établies par différents laboratoires (T. Huguet, INRA-CNRS Toulouse, D. Cook, Univ. de Davis, USA).

L'établissement d'une carte physique a principalement pour but de faciliter l'établissement de la séquence finale du génome. Deux banques génomiques, de 6 et 23 équivalents génome, construites dans un vecteur de type BAC (D. Cook), assurent une bonne couverture de l’ensemble du génome, et vont permettre la réalisation d’une carte physique.

L'hybridation moléculaire in situ sur métaphases colorées (FISH : Fluorescence In Situ Hybridization) permet de localiser et d'ordonner directement des sondes correspondant à des gènes, des marqueurs génétiques, etc. Il est ainsi possible d'établir des cartes cytogénétiques dont la résolution maximale est environ une à trois Mb.

II.6.6. Séquençage et Annotation du génome

L'annotation de génome est le processus par lequel la séquence d’ADN est analysé et l'information est ajoutée aux régions spécifiques pour décrire des dispositifs d'intérêt biologique, le plus important sont les gènes codant pour des protéines. Il y a deux composants distincts à l'annotation de génome: prédiction des structures de gène et description de la fonction putative des gènes. Un ensemble uniforme d’annotations du génome de M.

truncatula a été produit par coordination internationale en profitant de l'expérience acquise

avec d’autres plantes (Arabidopsis et le riz).

Pour la plante modèle M. truncatula, on estime qu’il a été séquencé 2000 BAC d’environ 300 Mpb en janvier 2007 (Young, N.: www.sgn.cornell.edu). On prévoit que 90% du génome exprimé sera séquencé fin 2008.