Outils de mesure des composantes sensorielles

A análise de expressão do gene NCS-1 através dos níveis de RNAm (RNA

mensageiro) foi feita através da metodologia RT-PCR (transcriptase reversa por reação de em

Anticorpo Catálogo Fornecedor

Anti-Ncs1(FL-190) #sc-13037 Santa Cruz Biotechnology Anti-Actina (clone C4) #MAB1501 Millipore

Anti-Tubulina (clone TU-20) #MAB1637 Millipore

Anti-Erk 1/2 (137F5): #4695 Cell Signalling Technology Anti-pErk 1/2 Thr202/Tyr204 (E10) #9160 Cell Signalling Technology Anti Gsk3β (3D10) #9832 Cell Signalling Technology Anti pGsk3β Ser9 (5B3) #9323 Cell Signalling Technology Anti Gsk3α (D80E5) #4337 Cell Signalling Technology Anti pGsk3α Ser21 (27E5) #5090 Cell Signalling Technology Anti Gsk3 α/β (D75D3) #5676 Cell Signalling Technology Anti pGsk3 α/β Ser 21/9 (37F11) #9327 Cell Signalling Technology Anti β-Catenina #9562 Cell Signalling Technology Anti Akt1 (C73H10) #2938 Cell Signalling Technology Anti- IgG camundongo IR 680 #5470 Cell Signalling Technology Anti- IgG camundongo IR 800 #5257 Cell Signalling Technology Anti- IgG coelho DyLight® 680 #5366 Cell Signalling Technology Anti- IgG coelho DyLight® 800 #5151 Cell Signalling Technology Anti-IgG-HRP coelho #7074 Cell Signalling Technology Anti-IgG-HRP camundongo #7076 Cell Signalling Technology

cadeia da polimerase). O RNA foi extraído com Trizol® (Life Technologies, Carlsbad – EUA)

a partir de células em cultura ou tecidos cerebrais homogeneizados, sintetizado a cDNA e em

seguida amplificados em tempo real com SYBR® Green utilizando primers específicos em um

equipamento apropriado para detecção de fluorescência.

3.11.1 Extração de RNA

RNA de diferentes tecidos ou culturas de células foram extraídos utilizando o reagente

Trizol® seguindo o protocolo do fabricante com mínimas modificações. Para células, o meio

de cultura foi removido e a camada celular foi rapidamente lavada duas vezes com PBS a 4 oC

e o preciptado celular foi obtido conforme previamente explicado. Em seguida, 300 µL de

Trizol® foi adicionado e a solução permaneceu em repouso por 5 minutos a temperatura

ambiente para a completa lise e dissociação de complexos formados por RNA e proteínas.

Para os tecidos cerebrais, dois protocolos de homogeneização tecidual foram utilizados. Estes

foram baseados em sonicação ou maceração na presença de Trizol®. Em ambos os casos,

assim como para células, a solução permaneceu em repouso a temperatura ambiente por 5

minutos após homogeneização para a completa lise e dissociação de complexos formados por

RNA e proteínas. Em seguida, adicionou-se 60 µL de clorofórmio em cada tubo contendo o

homogeneizado dissolvido em Trizol® e foi feita uma vigorosa homogeneização em vórtex.

Após centrifugação a 12.000 x g por 15 minutos a 4 oC, transferiu-se a fase aquosa da mistura

contida na parte superior para outro tubo contendo 150 µL de isopropanol (normalmente, 50%

do volume inicial de Trizol® utilizado). Novamente, incubou-se por 10 minutos à temperatura

ambiente e centrifugou-se a 12.000 x g por 10 minutos a 4 oC. O precipitado foi lavado com

etanol 75% (v/v) preparado com água-DEPC, seco à temperatura ambiente e redissolvido em

3.11.2 Quantificação de RNA total

Uma vez isolado, o RNA foi diluído 1:100 (RNA:TE) em cuvetas de quartzo e

quantificado através de espectrofotometria (Ultrospect 2100 pro, Amersham Biosciences,

Amersham, Reino Unido) medindo-se a absorbância a 260 e 280 nm, no qual um valor de

A260 = 1,00 equivale a 40 µg/ml de RNA. A relação A260/A280 também foi determinada

para se estimar o grau de pureza do RNA, sendo utilizado o valor entre 1,8 e 2,0 como ideal.

Em seguida o RNA foi estocado e mantido a -80 °C.

3.11.3 Eletroforese do RNA

Cerca de 1 µg de RNA foi separado em eletroforese de gel de agarose 1,0 % para

visualização da integridade do mesmo para controle de qualidade antes das reações de síntese

de cDNA (DNA complementar). Os parâmetros da corrida eletroforética seguiram os mesmo

padrões previamente explicados, a exceção de que, tanto a cuba quanto o tampão de corrida

TBE (5X : 446 mM Tris-Base; 445 mM ácido bórico; 10 mM EDTA; pH 8,0) foram

utilizados exclusivamente para RNA.

3.11.4 Reação da transcriptase reversa (síntese de cDNA)

Após diluição do RNA para 1 µg em 7,1 µL de água-DEPC, foi realizado o tratamento

enzimático com DNAse I para eliminar possíveis contaminações do RNA com DNA

genômico. Para tal, o meio reacional consistindo de tampão e DNAse I livre de RNAses (New

England Biolabs, Ipswich – EUA) foi adicionado as amostras como indicado pelo fabricante.

As reações foram incubadas a 37 °C por 10 min. Após o fim da reação, no intuito de inativar a

final de 5 mM) e, em seguida, estes foram transferidos novamente para o termociclador para

reação a 75 °C por 5 min. O cDNA foi sintetizado a partir dos 10 µL da solução tratada com

DNAse I. Além das amostras, incluíram-se os controles negativos “RT-”, no qual a mistura da

reação é desprovida da enzima transcriptase reversa, e “NTC”, o qual não possui RNA. As

condições de reação para esta síntese foram as indicadas no protocolo do kit comercial High

Capacity RNA-to-cDNA Kit (Life Technologies, Carlsbad – EUA), no entanto, foi utilizado um volume final de 20 µL.

3.11.5 qPCR

Após síntese do cDNA, os seguintes primers mostrados na Tabela 7 foram desenhados

utilizando o software online e gratuito Primer-BLAST para avaliar os níveis de expressão de

RNAm.

Tabela 7. Primers utilizados no qPCR.

Gene Primer Fc Primer Rd Genoma

NCS-1a GCCGCCGAGGATGGGGAAATC AGCTTGAAGGCCCACCGTAGC Humano

GCAGTGGTACAAGGGTTTCA CCGATAGAGCCTGGATGAAT Rato

AAGCCTCGGACTTTGAGACA CTGGACCACACCCCTAAAGA Camundongo

BACT b GCACAGAGCCTCGCCTTTGCC CATGCCCACCATCACGCCCTGG Humano AGCCATGTACGTAGCCATCC CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA Rato ou

Camundongo

a

NCS-1: sensor neuronal de cálcio tipo 1; bBACT: actina beta; cF: forward; dR: reverse

Para amplificação do cDNA, foi realizada uma PCR em tempo real com SYBR® Green normalizado pela fluorescência ROX. O protocolo recomendado pelo kit comercial

Brilliant™ SYBR® Green QPCR Master Mix (Agilent, Santa Clara – EUA) foi seguido com modificações mínimas no termociclador com leitura de fluorescência MX3005P (Stratagene

California, La Jolla – EUA) nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95 oC por 3

minutos, desnaturação a 95 oC por 30 segundos, anelamento dos primers e extensão a 60 oC

por 30 segundos. Cada amostra foi feita em quadriplicata biológica, usando também triplicata

de poços. Como controle negativo para a reação de PCR em tempo real foram utilizados

poços que continham a mistura da reação e os primers, mas ausência de cDNA, além dos

controles RT- e NTC. No final de cada reação foi realizada uma curva de dissociação para

avaliar a especificidade de amplificação. As possíveis variações na concentração inicial de

RNAm entre as amostras foram calculadas através da normalização do gene constitutivamente

expresso da actina beta (BACT). Para análise da expressão gênica, foi aplicado o método

compartivo Delta-Delta Ct (∆∆Ct) (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). Calculou-se inicialmente

o ∆CT de cada amostra, subtraindo-se os valores de CT (threshold cycle ou limiar do ciclo) do

gene controle (BACT) dos valores de CT do gene alvo. Após determinação do ∆CT da amostra,

escolheu-se como amostra normalizadora o cDNA de células cultivadas ou animais tratados

com o veículo de diluição dos fármacos (grupo controle). Para o cálculo do ∆∆CT utilizou-se

a seguinte fórmula: [∆CT (amostra) – ∆CT (amostra normalizadora)]. Uma vez determinado o

∆∆CT, aplicou-se a fórmula 2-∆∆CT, que resultou no valor da expressão gênica relativa.