LES ORIENTATIONS DU PDAU D’ALGER Plan stratégique de la ville d'Alger

A1) DETECÇÃO E ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO SOLO PRODUTORAS DE ANTIBIÓTICOS

A obtenção de antibióticos produzidos por microrganismos iniciou-se com a selecção de produtores provenientes do ambiente natural, para que na fase final se obtivesse uma cultura pura do microrganismo produtor. Utilizou-se uma amostra de solo rica em matéria orgânica, proveniente de um terreno não cultivado, onde se pesquisaram bactérias produtoras de antibióticos, principalmente do género Streptomyces. A amostra de solo recolhida deve colocar-se num local escuro, durante uma semana à temperatura ambiente, para secar, uma vez que este processo provoca a morte de outras bactérias que competiriam por nutrientes com as do género Streptomyces (Barnard, 1994). Deste

modo, as bactérias pretendidas, que formam esporos em ambientes secos, ficam em maior abundância crescendo posteriormente no meio de cultura (Ibid.).

As etapas, descritas e ilustradas no procedimento 9 (ver Anexo 13), para o isolamento de bactérias produtoras de antibióticos, iniciou-se com diluições sucessivas da amostra de solo recolhida (10º, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4), seguida do espalhamento de um volume conhecido da suspensão de solo (200 L) em meio de cultura sólido. Para a obtenção de isolados bacterianos descrevem-se e ilustram-se as etapas no procedimento 10 (ver Anexo 14). Após o isolamento de colónias, procedeu-se à verificação da sua capacidade produtora de antibióticos utilizando uma estirpe indicadora (Micrococcus

luteus), com recurso a três técnicas descritas e ilustradas no procedimento 11 (ver Anexo

15), nomeadamente: 1) por sobrecamada directa da estirpe indicadora nas placas de Petri provenientes das diluições do solo 10-3 e 10-4; 2) por isolamento de colónias e posterior sobrecamada com a estirpe indicadora; 3) pela técnica de riscado. Nas duas primeiras, as estirpes produtoras de antibióticos identificam-se pela presença de um halo de inibição do crescimento da estirpe indicadora circundando a colónia produtora (Figura 3.1 A). Na técnica de riscado, a produção de antibióticos verifica-se sempre que ocorrer inibição do crescimento da estirpe indicadora junto à extremidade do traço correspondente à colónia produtora (Figura 3.1 B).

Para esta actividade testaram-se dois meios de cultura selectivos (meio de isolamento e meio de crescimento) para a selecção de bactérias Actinomycetes do género Streptomyces, e um meio complexo, o nutrient agar (NA). A escolha de meios selectivos e complexos, destinou-se a comparar resultados, de modo a escolher o mais adequado para detectar e isolar bactérias produtoras de antibióticos em contextos escolares.

Figura 3.1 – Detecção da produção de antibióticos pela técnica de sobrecamada (A) e técnica de riscado (B). Os halos formam-se pela inibição do crescimento da estirpe indicadora em volta de colónias produtoras (A) e na extremidade do traço de crescimento da colónia produtora (B).

Halos de inibição do crescimento Colónias seleccionadas Estirpe indicadora Micrococcus luteus A B Halos de inibição do crescimento Colónias seleccionadas Estirpe indicadora Micrococcus luteus A B

Objectivos específicos:

 Desenvolver competências em técnicas de assepsia para a manipulação de microrganismos;

 Conhecer técnicas de isolamento de microrganismos em cultura pura a partir de uma população mista;

 Aplicar métodos de diluições sucessivas para isolar colónias a partir de populações mistas;

 Aplicar técnicas de inoculação de microrganismos (e.g. incorporação e espalhamento);

 Detectar produtos do metabolismo microbiano – antibióticos;

 Compreender conceitos de microbiologia/biotecnologia microbiana.

Cuidados a ter

:

 Antes de iniciar a actividade, desinfectar a bancada do laboratório com lixívia e acender a lamparina;

 Lavar bem as mãos e passá-las por álcool etílico;

 Cumprir rigorosamente as técnicas de assepsia para evitar qualquer tipo de contaminação microbiana indesejada, a nível pessoal, do ambiente de trabalho e do material utilizado, assim como, das culturas de microrganismos que se pretendem estudar (Oliveira & Pampulha, 2000);

 Os instrumentos de trabalho devem ser esterilizados e todos os procedimentos devem realizar-se de modo a minimizar a exposição ao ar (Ibid.);

 Depois de inoculadas com microrganismos, a incubação deve fazer-se com as placas de Petri invertidas, para evitar que as gotas formadas na tampa por condensação caiam sobre as culturas em crescimento;

 As placas de Petri com colónias crescidas podem guardar-se no frigorífico;

 Após a conclusão dos trabalhos, deve esterilizar-se no autoclave todo o material que contenha e/ou tenha estado em contacto com microrganismos do solo.

Materiais, reagentes e equipamentos

:

Os materiais, reagentes e equipamentos para este trabalho prático apresentam-se na Tabela 3.11. A preparação dos meios de cultura utilizados descreve-se no Anexo 1.

Tabela 3.11 – Materiais, reagentes e equipamentos para a detecção e o isolamento de bactérias do solo produtoras de antibióticos.

MATERIAL DE LABORATÓRIO E OUTRO EQUIPAMENTOS

 algodão cardado

 ansa de inoculação

 espalhador de vidro

 folha de alumínio

 2 frascos de vidro de 500 mL, com tampa, para autoclave (e.g. Schott)  frascos de urina  gaze  lamparina  marcador de acetato  1 micropipeta P200 e P1000

 palitos de madeira (esterilizados)

 película aderente

 1 placa de Petri de vidro

 10 placas de Petri com meio de isolamento (para as diluições)

 3 placas de Petri com meio de crescimento (para o isolamento de colónias)

 19 placas de Petri com meio NA (10 placas para as diluições, 3 para o isolamento de colónias e 6 para a técnica de riscado)

 régua

 1 suporte de tubos de ensaio (25 mm)  5 tubos de ensaio (20x150 mm)  pontas de 200 L e 1000 L (esterilizadas)  autoclave  balança de precisão  estufa  frigorífico  microondas

REAGENTES MATERIAL BIOLÓGICO

 água destilada

 solução de álcool etílico a 96% (v/v)

 cicloheximida9 (opcional)

 meio de isolamento (caseína hidrolisada, amido solúvel, nitrato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, fosfato de magnésio, carbonato de cálcio, agar)

 meio de crescimento (glicose, extracto de levedura, nitrato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, agar)

 meio de cultura NA (nutrient agar)

 meio de cultura NB (nutrient broth)

 1g de solo

 cultura em meio sólido de Micrococcus luteus

Procedimentos prévios:

 Recolher cerca de 5 g de solo a 10 cm da superfície. Guardar o solo no escuro (e.g. dentro de uma caixa fechada) durante uma semana, num saco de plástico aberto;

 Preparar as placas de Petri com os seguintes meios de cultura – isolamento, crescimento e NA;

 Esterilizar as pontas para as micropipetas e os palitos de madeira (e.g. em frascos de urina);

 Preparar os tubos de ensaio da seguinte forma: numerá-los de acordo com as diluições a efectuar (10º, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4) e, adicionar ao primeiro 10 mL de água destilada e 9 mL aos restantes quatro. Esterilizar os tubos tapados com as rolhas (formadas por algodão cardado envolvido em gaze), revestidas por folha de alumínio;

 Colocar a estirpe indicadora Micrococcus luteus a crescer em meio NA;

 Preparar 25 mL de meio líquido NB.

9 _{A cicloheximida é utilizada pela sua capacidade de inibir o crescimento de fungos (Barnard, 1994), sendo um inibidor da}

A2) AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE ANTIBIÓTICOS, ANTISSÉPTICOS E DESINFECTANTES EM BACTÉRIAS DO SOLO PRODUTORAS DE ANTIBIÓTICOS

Para verificar a capacidade de resistência e/ou sensibilidade de bactérias do solo produtoras de antibióticos (isoladas no trabalho prático anterior), quando sujeitas a diferentes agentes antimicrobianos, avaliou-se a eficácia de antibióticos, antissépticos e desinfectantes. Retiraram-se inicialmente alíquotas das bactérias produtoras de antibióticos e colocaram-se a crescer em meio líquido TSB. Após três dias de crescimento as bactérias foram inoculadas por dois processos: o primeiro, por incorporação em meio de cultura TSA (previamente fundido e mantido a 45-50ºC); o segundo, por espalhamento sobre o meio de cultura TSA sólido. As etapas concebidas e optimizadas descrevem-se e ilustram-se no procedimento 12 (ver Anexo 16).

Como antibióticos, sob a forma de discos de potência conhecida (quantidade do agente aplicada no disco em g ou U) (Alcântara et al.,2001), utilizou-se a penicilina (2 U) e a tetraciclina (10 g). Em comprimidos e cápsulas comerciais utilizaram-se, respectivamente, amoxicilina (Clamoxyl) e um macrólido (Macropen). Relativamente aos antissépticos utilizou-se a solução de álcool etílico a 96%, água oxigenada (10 volumes) e Betadine (solução dérmica comercial), e como desinfectantes, lixívia e

Amokina. A avaliação da eficácia destes agentes químicos efectuou-se pelo contacto com discos de papel de filtro saturados com o agente químico a testar e medindo o diâmetro das zonas de inibição do crescimento das estirpes bacterianas. O agente químico absorvido pelo agar circundante entra em contacto com a bactéria inoculada no meio de cultura (Alcântara et al., 2001) e, caso se verifique inibição do seu crescimento, considera-se que o agente testado se revelou eficaz relativamente à bactéria estudada.

A sequência de discos de papel de filtro com antibióticos, antissépticos e desinfectantes, colocados nas placas de Petri inoculadas por incorporação e espalhamento, representam-se na Figura 3.2.

Figura 3.2 – Sequência de discos de papel de filtro embebidos com antibióticos, antissépticos e desinfectantes nas placas de Petri inoculadas por incorporação (A) e espalhamento com a zaragatoa (B). P – penicilina, H2O – água destilada (esterilizada), H2O2 – peróxido de hidrogénio (água oxigenada a 10 volumes), T – tetraciclina, Al – álcool etílico, Am – Amokina, B – Betadine, L – lixívia, M – macrólido, A – amoxicilina. A marcação a preto no topo das placas de Petri indica a sequência dos discos de papel de filtro indispensável para registar as observações e interpretá-las.

Objectivos específicos:

 Desenvolver competências em técnicas de assepsia utilizadas na manipulação de culturas puras;

 Aplicar técnicas de inoculação de microrganismos (e.g. incorporação e espalhamento);

 Conhecer o comportamento de algumas estirpes bacterianas produtoras de antibióticos quando expostas a diferentes substâncias antimicrobianas;

 Compreender conceitos de microbiologia.

Cuidados a ter

:

Os mesmos para o trabalho prático anterior.

Materiais, reagentes e equipamentos

:

Os materiais, reagentes e equipamentos para este trabalho prático apresentam-se na Tabela 3.12.

Placas inoculadas por incorporação Placa inoculada por espalhamento com a zaragatoa M T A P H2O T H2O2 Al Am B L M A A B

Placas inoculadas por incorporação Placa inoculada por espalhamento com a zaragatoa M T A P H2O T H2O2 Al Am B L M A A B

Tabela 3.12 – Materiais, reagentes e equipamentos para a avaliação da eficácia de antibióticos, antissépticos e desinfectantes em bactérias do solo produtoras de antibióticos.

MATERIAL DE LABORATÓRIO E OUTRO EQUIPAMENTOS

 ansa de inoculação

 discos de papel de filtro (Antibiotic assay discs, e.g. Whatman)

 4 frascos de vidro de 100 mL, com tampa, para autoclave (e.g. Schott)

 5 frascos de urina (esterilizados)

 1 frasco com água destilada (esterilizado)

 2 frascos de vidro de 100 mL, com tampa, para autoclave (esterilizados)

 lamparina

 marcador de acetato

 micropipeta P1000

 12 placas de Petri (esterilizadas)

 4 placas de Petri com meio TSA

 régua

 1 suporte de tubos de ensaio (25 mm)

 4 tubos de ensaio de tampa metálica, cada um com 10 mL de meio TSB (esterilizados)  pontas de 1000 L (esterilizadas)  zaragatoa  autoclave  balança de precisão  estufa  frigorífico

REAGENTES MATERIAL BIOLÓGICO

 água destilada (esterilizada)

 solução de álcool etílico a 96% (v/v)

 Amokina – 10 mL

 Betadine (solução dérmica comercial) – 10 mL

 Clamoxyl – 1 comprimido de 1 g

 discos de papel com penicilina (2 U)

 discos de papel com tetraciclina (10 g)

 lixívia comercial – 10 mL

 Macropen – 1 cápsula de 500 mg

 meio de cultura TSA (Tryptic soy agar)

 meio de cultura TSB (Tryptic soy broth)

 água oxigenada comercial a 10 volumes (3%) – 10 mL

 bactérias do solo produtoras de antibióticos isoladas anteriormente

Procedimentos prévios:

 Preparar as placas de Petri com meio TSA e os tubos de ensaio de tampa metálica com 10 mL de meio líquido TSB em cada um;

 Esterilizar as pontas para a micropipeta, o frasco com água destilada, os frascos de urina e os tubos de ensaio com meio líquido TSB;

 Preparar 4 frascos de vidro com 80 mL de meio TSA, à temperatura de 45-50ºC (e.g. Schott);

 Diluir os antibióticos em água destilada esterilizada: Macropen 500 mg/50 mL de água (10 mg/mL); Clamoxyl 1000 mg/100 mL de água (10 mg/mL). Em função da solubilidade do antibiótico, a concentração final poderá ser inferior à calculada.

A3) DETECÇÃO DE ENZIMAS PRODUZIDAS POR BACTÉRIAS DO SOLO

Nesta actividade utilizou-se uma amostra de solo rica em matéria orgânica proveniente do mesmo local onde se recolheu a amostra para os trabalhos práticos anteriores. Como se referiu na actividade “Detecção e isolamento de bactérias do solo

produtoras de antibióticos”, secou-se a amostra de solo depois de recolhida, colocando-a

hidrolíticas extracelulares – amilases – produzidas por bactérias do solo utilizou-se o meio NA suplementado com amido solúvel (EIBE, 1995; Oliveira & Pampulha, 2000). Conceberam-se e optimizaram-se dois procedimentos: o primeiro consistiu no espalhamento em meio de cultura sólido de volumes conhecidos (200 L) da suspensão de solo, obtidos a partir de diluições sucessivas da amostra recolhida (10º, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4) (ver procedimento 9, “Isolamento de bactérias do solo”, Anexo 13); o segundo consistiu na obtenção de dois poços no meio de cultura, introduzindo água destilada esterilizada num dos poços e o mesmo volume da suspensão de solo (também proveniente das mesmas diluições) no outro poço (ver procedimento 13, Anexo 17).

Após a incubação, detectou-se a actividade hidrolítica determinando a presença, ou ausência, de amido no meio de cultura. Para tal, efectuou-se o teste com soluto de Lugol, que permite identificar a presença de amido pela coloração azul arroxeada (EIBE, 1995; Oliveira & Pampulha, 2000), a qual indica ausência de enzimas capazes de hidrolisar o amido – corresponde a um resultado negativo. A ausência deste polissacarídeo origina uma zona clara (zona de hidrólise) em torno dos microrganismos produtores de amilases – corresponde a um resultado positivo (Oliveira & Pampulha, 2000) (Figura 3.3). Esta zona de hidrólise resulta da degradação enzimática do amido em compostos que não reagem com o iodo do soluto de Lugol (Ibid.).

Figura 3.3 – Zonas de hidrólise do amido em torno de bactérias produtoras de amilases, após adição do soluto de Lugol (resultado positivo). Inoculação por espalhamento (A) e adição do inóculo num dos poços (B).

Objectivos específicos:

 Desenvolver competências em técnicas de assepsia utilizadas na manipulação de microrganismos;

 Aplicar técnicas de inoculação de microrganismos (e.g. espalhamento e adição do inóculo em poços no meio de cultura);

 Aplicar métodos de diluições sucessivas para isolar colónias a partir de populações mistas;

 Avaliar a capacidade de microrganismos produzirem enzimas hidrolíticas extracelulares;

 Detectar produtos do metabolismo microbiano – amilases;

 Compreender conceitos de microbiologia/biotecnologia microbiana.

Cuidados a ter

:

Os mesmos que foram referidos para os trabalhos práticos com bactérias do solo.

Materiais, reagentes e equipamentos

:

Os materiais, reagentes e equipamentos para este trabalho prático apresentam-se na Tabela 3.13.

Tabela 3.13 – Materiais, reagentes e equipamentos para a detecção de enzimas produzidas por bactérias do solo.

MATERIAL DE LABORATÓRIO E OUTRO EQUIPAMENTOS

 1 agulha lanceolada

 algodão cardado

 espalhador de vidro

 folha de alumínio

 1 frasco de vidro de 1000 mL, com tampa, para autoclave (e.g. Schott)

 furador de rolhas (5 mm)  gaze  1 gobelé de vidro de 50 mL  lamparina  marcador de acetato  micropipeta P200  1 pipeta de vidro

 1 placa de Petri de vidro

 pontas de 200 L (esterilizadas)

 24 placas de Petri com meio NA e amido solúvel

 régua

 1 suporte de tubos de ensaio (25 mm)

 5 tubos de ensaio (20x150 mm)  autoclave  balança de precisão  estufa  frigorífico REAGENTES MATERIAL BIOLÓGICO  amido solúvel  água destilada

 solução de álcool etílico a 96% (v/v)

 meio de cultura NA

 soluto de Lugol

 1g de solo

Procedimentos prévios:

 Recolher a amostra de solo e preparar os tubos de ensaio para as diluições, como se descreveu para a actividade “Detecção e isolamento de bactérias do solo produtoras

de antibióticos”;

 Preparar as placas de Petri com meio de cultura NA suplementado com amido solúvel (adicionar 20 g de meio NA e 2 g de amido, e perfazer o volume de 1000 mL com água destilada);

Figura 3.4 – Estrutura da laranja

(Retirada de Madden, 2000, p.5).

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