Chapitre 2: : Matériel et méthodes
2.3. Méthodes
2.3.1. Observation des cellules de bois
2.3.1.1. La microscopie optique
Pour tous les individus prélevés en forêt ou en serre, des sections de 25-50 µm de bois sont découpées avec un microtome. Selon le tissu étudié, l’écorce est parfois en-levée avant la coupe. Vu le nombre de coupes à produire, nous utilisons au labora-toire un outil de coloration par série appelé « colorospeed » mis au point par Frédé-ric Petitclerc (EcoFoG). Il s’agit de 10 tubes eppendorfs dont le fond a été percé avec une aiguille, attachés à une structure qui permet aisément de remplir et vider les eppendorfs de colorants. Les colorants utilisés sont la safranine pour mettre en évi-dence les tissus lignifiés et le bleu astra qui colore les parties contenant des poly-saccarides en bleu (le protocole détaillé est donné en annexe). Les coupes sont habi-tuellement réalisées dans le plan transversal du bois (plan RT), mais pour certaines études des coupes longitudinales - tangentielles (LT) à plusieurs épaisseurs de l’écorce ainsi que des coupes longitudinales - radiales du bois ont été ajoutées. Après coloration, les coupes sont montées entre lames et lamelles et observées en micros-copie optique. Un appareil photo monté sur le microscope permet de créer une base de données photographique des bois et des écorces étudiés.
Les colorants en safranine et bleu astra sont souvent décrits comme étant peu fiables dans le domaine de l’étude du bois de tension, car jugés peu spécifique pour la lignine. Cependant la couche G du bois de tension a été majoritairement connue pour son aspect non lignifié (Ghislain & Clair 2017) et les traces de lignine appa-raissant dans la couche G étaient considérées comme des erreurs de colorations. Ces colorants pourraient donc être fiables. En guise de vérification, les sections de 25-50 µm en coloration safranine et bleu astra sont comparées à des coupes bien plus fines (2-3 µm) non colorées en utilisant l’autofluorescence de la lignine, qui est une propriété naturelle des lignines (Figure 38). Les échantillons doivent être inclus dans de la résine, selon la méthode décrite dans Clair et al. (2005a). Puis des sections de 2-3 µm sont découpées à l’aide d’un couteau diamant monté sur un microtome rotatif (LEICA RM2255). La coupe est observée simultanément avec la microscopie optique classique afin d’apprécier l’épaisseur de la paroi, et avec une lampe excitant les lignines qui vont renvoyer un signal lumineux en épiscopique. Une lampe UV USH102D est utilisée avec un filtre U-MNU2 (Excitation filter BP 360-370 nm, Di-chromatique mirror DM 400 nm, Emission filter LP 420 nm). L’excitation se fait entre 360 et 370 nm, des valeurs comparables à la littérature (Donaldson & Radotic 2013), bien que selon le spectre d’absorbance des lignines, l’excitation optimale se-rait entre 270 et 300 nm. Néanmoins le signal obtenu est suffisamment clair que pour tirer des conclusions.
Outre l’utilisation pour la vérification de l’efficacité de la double coloration safra-nine/bleu astra, cette technique est utilisée pour l’observation des couches G
multi-couches. En effet les couches fines sont parfois difficiles à observer sur des coupes de 25-50 µm.
2.3.1.2. La microscopie confocale à balayage laser tridimensionnel (3D)
Une autre technique de microscopie a été utilisée spécialement pour l’étude des bois de tension contenant des couches G multicouches : la microscopie confocale à ba-layage laser tridimensionnel (Keyence VK-9710K). Elle permet d’observer la topo-graphie de la surface d’un échantillon avec une résolution de 10 nm. La surface d’échantillons de bois sec non traités est rafraichie par un couteau diamant afin d’obtenir une surface presque parfaite. Les changements d’organisation ou de com-position entre deux couches de la paroi des fibres produisent des traces topogra-phiques qui permettent d’identifier facilement les couches ou sous-couches de la pa-roi.
2.3.1.3. La microscopie électronique
La microscopie électronique permet d’observer la paroi même des fibres de bois. Afin d’observer l’organisation du réseau de microfibrilles de celluloses de la couche G, j’ai eu l’occasion de visiter le laboratoire Tree Cell Biology du Prof. K. Takabe de l’Université de Kyoto dans le cadre d’un JSPS Summer Program pendant l’été 2015. Le laboratoire est muni d’un microscope en transmission électronique (TEM) ainsi qu’un microscope électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM). La pré-paration pour le TEM nécessite la technique de « Rapid Freeze and Deep Etching » (RFDE). Cette technique consiste à couper un échantillon à froid, entre 106 et -150 °C, afin de ne pas modifier sa structure. Elle est habituellement utilisée sur des cultures de cellules et des difficultés ont été rencontrées pour découper un matériau bien plus dense comme le bois.
L’étude de l’organisation du réseau de microfibrilles de celluloses a été mise en place sur trois espèces inclinées tuteurées à 45°: Populus carolinensis x P. nigra, I-214 de 4 ans récolté en juillet 2015 à Kyoto17 après 21 jours d’inclinaison, Laetia procera et Simarouba amara récoltés à l’UMR EcoFoG à Kourou.
2.3.1.3.1. Préparation “Rapid Freeze and Deep Etching” (RFDE) et observation en micro s-copie à transmission électronique (TEM)
La congélation rapide de la RFDE se réalise normalement avec du propane à l’état liquide préparé via du propane gazeux passé dans de l’azote liquide (-196 °C). La méthode alternative utilisée lors de mon JSPS Program est de mettre les échantil-lons de 2 mm x 0,1 mm x 2,5 mm (radial x tangentiel x longitudinal) dans une solu-tion 40 % méthane et le reste d’eau distillée dès qu’ils sont coupés. Ils sont ensuite plongés dans de l’azote liquide au moins 30 s, dans un bac préparé en papier filtre. Les échantillons sont alors transvasés dans un petit tube marqué et percé (sinon le
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Station Expérimentale de Kitashirakawa du “Field Science Education and Research Center” de l’Université de Kyoto
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tube risque d’exploser sous la pression de l’azote) qui baigne toujours dans l’azote liquide.
La fracture de l’échantillon par une lame rasoir se fait idéalement entre 106 et -150 °C (McCann et al. 1990; Fujino & Itoh 1994; Nakashima et al. 1997; Hafren et al. 1999) au moyen d’un JFD9010. Le « etching » se déroule pendant 15 min à -95 °C (Fujino & Itoh 1994; Hafren et al. 1999). La surface de l’échantillon est en-suite enrobé de Pt/C à un angle de 15 ° et à 2,5 kV, de C à un angle de 90 ° à 70 mA et encore de C à 70 ° et 70 mA (Figure 21).
Figure 21. Schéma du protocole de « Rapid Freeze and Deep Etching » (RFDE) utilisé, modifié d’après Shotton
(2006). Les étapes du protocole qui ont été modifiées sont décrites en gras. Les réglages indiqués en rouges ont
été suivis (Fujino & Itoh 1994; Nakashima et al. 1997; Hafren et al. 1999).
Le réplica métallique est isolé par digestion du bois. Pour cela, du collodion 1 % dans de l’isoamyl acétate met un film de protection sur le métal. Du Potassium di-chromate 5 % dans 50 % H2SO4 est ajouté pendant une nuit entière dans le but de digérer le bois. Les réplicas métalliques sont rincés à l’eau (3 x 15 min) puis à 3 x à l’isoamyl acétate pour enlever le collodion. Ils sont posés sur un fin porte objet (cop-per grid F-200 avec film de solution 1 % FORMVAR dans du chloroforme chauffé dessus) et mis au four.
Des photographies sont ensuite prises avec le TEM.
Après 2 mois d’essais infructueux, le protocole de préparation pour l’observation au microscope à transmission électronique (TEM) n’était pas au point et le réplica mé-tallique se cassait en plusieurs morceaux lors de sa récolte sur le porte objet. Plu-sieurs morceaux du réplica se superposaient, de sorte qu’il était impossible de loca-liser une cellule observée par rapport au cambium. En outre, la phase de « etching »
devait probablement être améliorée car certaines cellules étaient remplies d’un li-quide lors de l’enrobage métallique, masquant ainsi la couche G. Les observations au TEM n’ont donné aucun résultat satisfaisant.
2.3.1.3.2. Microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM)
L’échantillon est conservé dans de l’eau distillée. Un microtome adapté permet de découper une section radiale de 50 µm d’épaisseur de l’échantillon gelé dans une goutte d’eau. Cette section est transvasée dans de l’eau distillée dégelé. Elle est en-suite déshydratée par des séries de 15 min d’éthanol (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 3 x 95 %, 99,5 %), suivies de séries au t-Butanol de 15 min (3 x 100 %). Le pot con-tenant les sections est couvert d’un bout d’aluminium transpercé et plongé 1 à 2 minutes dans de l’azote liquide (-196 °C) avant de rester 6 h dans le « Freeze Drying » afin d’être mis sous vide.
Certaines sections se courbent lors des manipulations. Les sections les plus planes sont sélectionnées et une lame de rasoir lavée à l’éthanol permet de découper une surface de 5 mm x 5 mm. L’échantillon est collé sur un porte objet à l’aide de scotch double face et couvert d’une couche de Platine (Pt) au moyen d’un Ion Sputter (e-1045) pendant 15 s et avec 30 mA.
Des photographies sont ensuite prises au moyen d’un FE-SEM. Dans le but de dé-crire le réseau de microfibrilles de cellulose, l’intérieure de la paroi de la couche G est observée depuis le cambium jusqu’à la maturation complète de la fibre.
2.3.1.4. Diffraction par rayon X
L’angle des microfibrilles de cellulose (AMF) est mesuré sur des échantillons de la taille d’une allumette de bois de tension et de bois opposé de 22 individus de 22 espèces différentes via la méthode de diffraction par rayon X (Cave 1966; Yama-moto et al. 1993). L’AMF est mesuré par T. Alméras au LMGC de Montpellier. Un deuxième lot de 27 individus de 6 espèces différentes est mesuré par B. Clair. Outre le bois, l’écorce du côté tension et opposé est étudié.