L’électrogénothérapie (EGT) est une méthode de transfert de gène efficace in vitro cependant tous les mécanismes du transfert d’ADN par électroporation ne sont pas encore complètement élucidés, en particulier dans le contexte in vivo (Escoffre, Portet et al. 2009). Plusieurs études démontrent que dans certains tissus tels que les tumeurs et la peau, l'expression des gènes est moins efficace que sur les cellules cultivées in vitro (Rols, Delteil et al. 1998; Vandermeulen, Staes et al. 2007). Dans le contexte in vivo, les vecteurs plasmidiques doivent surmonter plusieurs obstacles avant d’accéder à la machinerie d’expression protéique de la cellule cible. L'un des principaux obstacles au mouvement du plasmide est l’organisation et la densité de la matrice extracellulaire qui vont jouer un rôle majeur dans la distribution de ce dernier au sein du tissu (Zaharoff, Barr et al. 2002; Mesojednik, Pavlin et al. 2007; Escoffre, Teissie et al. 2010). La littérature démontre en effet l’implication de la matrice extracellulaire car l’altération par voie enzymatique de la matrice extracellulaire tumorale augmente significativement l’efficacité de l’électrotransfert d’ADN (Zaharoff, Barr et al. 2002; Henshaw, Mossop et al. 2008; Cemazar, Golzio et al. 2012).Il est donc nécessaire de mieux caractériser les interactions plasmide-matrice extracellulaire afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l’électrotransfert d’ADN in vivo pour pouvoir développer des stratégies visant à améliorer l’efficacité de cette technologie.
Actuellement, les tests in vitro emploient des modèles d’études simples pour comprendre les mécanismes de l’électroporation (vésicules lipidiques artificielles, modèles cellulaire 2D en suspension ou en monocouche). Pour développer de futures applications cliniques l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour attester des réponses in vivo de cette technique. Ces différents modèles sont indispensables mais il est vrai qu’ils ne présentent pas parfaitement les caractéristiques natives des tissus humains. Il est donc nécessaire de développer des modèles tissulaires plus complets mimant l’architecture et l’organisation 3D des tissus chez l’homme (Pampaloni, Reynaud et al. 2007; Ghajar and Bissell 2010; Nyga, Cheema et al. 2011). À cet effet, il est intéressant d’utiliser des modèles de peau humaine reconstruits par ingénierie tissulaire car dans le domaine de l’électrotransfert d’ADN, la peau, un organe riche en matrice extracellulaire, est une cible tissulaire stratégique en raison de sa grande surface, de son
accessibilité et de ses propriétés immunologiques (Titomirov, Sukharev et al. 1991; Rochard, Scherman et al. 2011).
Le but de cette thèse était de développer/utiliser un modèle cutané humain comme outil pour étudier les mécanismes fondamentaux de l’électrotransfert d’ADN à l’échelle tissulaire. La méthode d’auto-assemblage sera employée tout au long de cette étude afin de produire in vitro des modèles tissulaires humains en 3D les plus proches des conditions natives in vivo. Dans cette approche, les cellules (i.e les fibroblastes dermiques humains) produisent et modèlent leur propre matrice extracellulaire, sans apport de matériel exogène. Ce travail de thèse est divisé en trois parties afin de répondre à différentes questions.
1ère partie
Le premier objectif consiste à évaluer et caractériser l’organisation de la matrice extracellulaire de modèles tissulaires 3D en utilisant des techniques de coloration histologique et de microscopies électroniques sur des échantillons fixés. Cette première partie sera effectuée sur deux modèles utilisés au laboratoire : le sphéroïde et le substitut dermique. Dans un second temps des impulsions électriques de l’ordre de la milliseconde seront appliquées sur le modèle choisi afin de s’assurer que l’application d’un champ électrique externe perméabilise efficacement et de façon homogène toutes les cellules composant le tissu 3D. La microscopie à deux photons permettra d’obtenir, sur des échantillons frais, des informations à la fois sur la localisation spatiale des cellules électroperméabilisées et sur l’organisation structurale des collagènes fibrillaires grâce la génération de seconde harmonique. Ces travaux ont fait l’objet d’un article sur lequel je suis première auteur, publié en 2015 dans Journal of Membrane Biology.
2ème partie
Le deuxième objectif consiste à évaluer les paramètres optimaux pour un électrotransfert de gène efficace à l’échelle du substitut dermique humain. Pour cela, des impulsions électriques de l’ordre de la milliseconde seront appliquées avec une gamme de champ électrique croissant sur le tissu. En outre, une analyse de l’efficacité de transfert d’un gène rapporteur codant pour la GFP (green fluorescent protein) au sein du modèle tissulaire permettra de valider ce modèle en comparant les taux de transfection obtenus avec ceux disponibles dans la littérature pour la
peau. En parallèle une étude de la biodistribution du plasmide marqué de façon fluorescente permettra de comparer la localisation du plasmide avec celle des cellules exprimant le gène rapporteur. Ces travaux ont fait l’objet d’un article sur lequel je suis première auteur, publié en 2016 dans Current Gene Therapy.
3ème partie
Le troisième objectif consiste à caractériser et comparer les effets directs et/ou indirects de champs électriques de type électrochimiothérapie (ECT), électrotransfert de gène (EGT) et électroporation irréversible (IRE) sur l’organisation du collagène fibrillaire dans le substitut dermique humain en utilisant la génération de seconde harmonique. Pour cela, les expériences seront effectuées en utilisant des substituts dermiques frais et des substituts dermiques décellularisés qui permettent de s’affranchir de la composante cellulaire dans la réponse observée. Les méthodes de caractérisation utilisées précédemment permettront d’étudier l’impact de la décellularisation sur l’organisation de la matrice extracellulaire au sein du substitut dermique, l’objectif étant de ne pas affecter la matrice extracellulaire suite à la décellularisation. Cette étude permettra de mettre en évidence les modifications potentielles de la structure et de l’organisation des collagènes fibrillaires au sein du tissu après électroporation avec des paramètres électriques de type ECT, EGT et IRE. Cet objectif sera valorisé dans un manuscrit en cours de rédaction sur lequel je serai première auteur et qui sera soumis à Biomaterials.