Objectifs et organisation du projet

Le travail présenté dans ce manuscrit porte sur l’étude des différentes conformations du transporteur

d’ADP/ATP mitochondrial. Cette protéine est depuis longtemps étudiée au sein du laboratoire via

des approches biochimiques, biophysiques et structurales, comme la spectroscopie de fluorescence, l’immunoréactivité, le marquage chimique, la cristallographie. Afin de compléter et d’affiner les nombreuses données déjà collectées sur cette protéine et comprendre son mécanisme d’action, l’étude du transporteur d’ADP/ATP par DXMS a été entreprise en collaboration avec le laboratoire de Spectrométrie de Masse des Protéines (LSMP) de l’Institut de Biologie Structurale de Grenoble. Cette technique innovante est de plus en plus utilisée dans des études structurales et fonctionnelles de protéines solubles et permet d’obtenir des informations sur leur dynamique moléculaire. Le récent développement de cette méthode associé à l’étude de protéines interagissant transitoirement avec des membranes ouvrent la porte à l’étude de protéines membranaires intégrales comme le transporteur d’ADP/ATP mitochondrial.

Dans cet objectif, mon projet s’est appuyé sur l’expertise technique de l’équipe Transporteur Mitochondrial et du LSMP. Premièrement, la connaissance approfondie de la biochimie des protéines membranaires et plus particulièrement du transporteur d’ADP/ATP a été un atout majeur dans la réalisation de ce projet. De plus, l’expertise du LSMP dans la technique de DXMS m’a permis de mieux appréhender son développement pour l’étude des protéines membranaires intégrales.

L’exposé de ce travail est divisé en trois parties. La première concerne les mises au point effectuées pour adapter les conditions d’analyses des cinétiques de marquage par échange hydrogène/deutérium à l’étude des protéines membranaires. Ce développement constitue une amélioration significative de la technique car il s’agit de la première protéine membranaire intégrale étudiée à l’aide de cette approche. Il s’inscrit dans la suite des travaux des membres du LSMP visant à améliorer la technique de DXMS pour l’étude des protéines et à la rendre la plus ubiquitaire

possible (Cravello et al., 2003; Man et al., 2007).

La seconde partie traitera des données obtenues et des informations qu’elles apportent sur la compréhension des différentes conformations qu’adoptent les deux complexes transporteurs inhibiteurs (transporteur-CATR et transporteur-BA). Je rappellerai ici que l’utilisation de ces inhibiteurs permet de bloquer la protéine dans des conformations stables représentant des étapes clés du mécanisme de transport. La structure tridimensionnelle à haute résolution du complexe bAnc1p-CATR a servi de base à l’analyse des différentes cinétiques d’échange H/D et nous a permis de valider les résultats d’accessibilité aux solvants obtenus pour ce complexe

(Pebay-Peyroula et al., 2003). Enfin, en confrontant les nombreuses données de la littérature aux différentes

cinétiques d’échange et en comparant entre elles ces cinétiques, nous avons pu acceder à des différences de conformations entre les complexes protéine-inhibiteur et proposer des modèles pour le complexe bAnc1p-BA.

La troisième partie de mes travaux a porté sur l’analyse de l’accessibilité des différentes régions de

bAnc1p par DXMS au sein des membranes mitochondriales. Cette étude in organello apporte un

progrès technique et ouvre la possibilité d’étudier d’autres conformations du transporteur de nucléotides. En effet, elle représente la première analyse par DXMS d’une protéine dans son environnement naturel et a nécessité la mise au point d’une méthode de purification très rapide dans les conditions de contre-échange minimum (milieu acide, basse température). La réalisation du marquage avant les étapes d’extraction, de purification, et de concentration, nécessaires à la préparation de la protéine pour les expériences de DXMS en état micellaire, a aussi permis de s’affranchir des risques d’altération de la conformation du transporteur lors de ces différentes étapes, qui sont tout autant de facteurs pouvant biaiser les résultats obtenus. De plus, réaliser le marquage au sein des mitochondries permet d’utiliser des ligands de faible affinité, dont la fixation aurait été compromise lors de l’étape de concentration, et d’accéder ainsi à des conformations différentes de celles imposées par le CATR ou le BA. Une fois mise au point, cette technique a permis de réaliser des cinétiques d’échange H/D du transporteur au sein des membranes mitochondriales et d’obtenir, sans l’aide de modifications chimiques, les premières données d’accessibilité d’une protéine membranaire dans son environnement naturel.

Dans un dernier volet, j’ai abordé l’étude des mutations pathogènes du transporteur hAnc1p humain à l’aide de méthodes biochimiques. Ce travail, initié dans l’équipe, a nécessité la validation d’un nouveau modèle pour appréhender l’effet des mutations humaines, afin de pallier les problèmes exposés précédemment. En effet, l’étude de ces transporteurs est difficile au sein de la levure et dans des cultures cellulaires à cause respectivement de leur très faible expression et de leur répression. De plus, la non-conservation des acides aminés des régions où sont localisées certaines mutations humaines chez les transporteurs ScAnc2p et hAnc1p ne permet que difficilement l’analyse de l’effet de ces mutations au sein de la levure. Celle-ci représente pourtant un organisme de choix pour étudier les transporteurs mitochondriaux.En effet, l’alternance possible entre des métabolismes respiratoires et fermentaires, permettant d’étudier des mutants non fonctionnels du transporteur. Notre approche s’est donc orientée vers l’utilisation d’un modèle mixte composé de l’organisme d’étude le plus approprié, c'est-à-dire la levure, et d’un transporteur d’ADP/ATP plus proche du transporteur humain et bien exprimé chez la levure, le transporteur mitochondrial

d’ADP/ATP de l’amibe Dictyostelium discoideum, DdAncAp. Ce modèle a été validé après avoir

vérifié que l’expression de DdAncAp restaurait efficacement la croissance d’une souche de levure dépourvue de transporteur endogène fonctionnel.