D. NASH
II. Objectifs de la thèse
Comme évoqué en introduction, la stéatose hépatique constitue la porte d’entrée d’une cascade pathologique pouvant conduire au développement d’une cirrhose et éventuellement d’un CHC, pour lequel il n’y a pas, actuellement, de traitement efficace. Face au manque de thérapies efficaces, il est donc nécessaire d’identifier les mécanismes favorisant la progression de cette cascade pathologique afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Parmi les causes susceptibles d’engendrer le développement de la stéatose hépatique, un déséquilibre dans la balance stockage (l’activité de la LDN) et utilisation (β-oxydation) des lipides est assez fréquent (Geisler and Renquist, 2017). L’expression des enzymes impliquées dans ces cascades biochimiques sont finement régulées par un certain nombre de facteurs de transcription parmi lesquels ChREBP, SREBP1c ou PPARγ pour la LDN et principalement PPARα pour la β-oxydation. L’activité de ces facteurs de transcription est régulée par des modifications post-traductionnelles (phosphorylation, acétylation par exemple) mais aussi par la capacité de ces protéines à atteindre leurs éléments de réponse au niveau de la chromatine. Ainsi, l’accessibilité des éléments de réponse dépend directement de l’état de compaction de la chromatine, régulée par de très nombreux facteurs nucléaires comme les histones mais aussi par les protéines HMG, dont HMGB1, qui est, après les histones, la protéine la plus abondante dans le noyau (Müller et al., 2004).
Il est de plus très intéressant de noter qu’HMGB1 semble jouer un rôle clef dans le métabolisme hépatique puisqu’en effet, la létalité périnatale de son KO global serait due à une hypoglycémie, liée à une mauvaise dégradation des stocks hépatiques de glycogène dans les 24 heures qui suivent la naissance des souriceaux (Calogero et al., 1999).
Des résultats non publiés du laboratoire ont montré que, dans un modèle murin de stéatose liée à la progression de l’obésité, l’expression génique (Fig 29A) et les taux protéiques (Fig 29B) hépatiques d’HMGB1 sont significativement augmentés renforçant ainsi le lien entre HMGB1 et le métabolisme hépatique.
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Figure 29 : Evolution de l'expression génique et protéique d'HMGB1 au cours de la stéatose.
Après trois mois de régime HFD60% l’expression génique (A.) et protéique d’HMGB1 (B.) est significativement augmentée.
De plus, des résultats préliminaires du laboratoire ont montré que, chez la souris, les niveaux circulants d’HMGB1 sont augmentés au cours d’un stress métabolique induit par différentes approches nutritionnelles (de 10ng/mL en chow diet à 15-25ng/mL en HFD ou choline deficient diet, respectivement, Fig 30).
Figure 30 : Evolution des concentrations plasmatiques d'HMGB1 lors d'un stress métabolique.
Après trois mois de HFD60% (HFD 3M), comme après deux mois de régime déficient en choline (CD-HFD 2M), les concentrations circulantes d’HMGB1 sont significativement augmentées par rapport au contrôle normal diet (ND).
Des études chez des sujets obèses et diabétiques rapportent une augmentation des concentrations circulantes d’HMGB1 aussi bien chez l’enfant (Arrigo et al., 2013) que chez l’adulte (Guzmán-Ruiz et al., 2014; Wang et al., 2015a). Dans un contexte d’inflammation de bas bruit, et en considérant son
95 pouvoir pro-inflammatoire, HMGB1 circulant pourrait réguler l’inflammation et les altérations métaboliques, comme la stéatose hépatique, générées par la progression de l’obésité. En effet, au cours d’un stress métabolique généré par un régime high fat court (deux semaines), l’inhibition de la forme circulante d’HMGB1 diminue l’infiltration des cellules immunes dans le foie (Fig 31A) et le tissu adipeux (Fig 31C), permet une réduction de la fibrose du foie (Fig 31B) et du tissu adipeux (Fig 31D), ainsi qu’une diminution significative de la stéatose (Fig 31E). Ainsi, l’inhibition d’HMGB1 a un effet significatif sur l’inflammation des tissus métaboliques et prévient la progression de la stéatose.
Figure 31 : Un traitement court avec inhibiteur de la sécrétion d'HMGB1 limite les conséquences d'un stress métabolique. Au cours d’un stress métabolique induit par un régime HFD60% de 2 semaines les animaux reçoivent soit le véhicule (Veh, n=10) soit un inhibiteur de la sécrétion d’HMGB1 (ICM, n=10). A la fin du traitement, l’expression génique des marqueurs de l’inflammation Emr1 et Ptprc et de la fibrose Col1a1 et Acta2 est mesurée par qPCR dans le foie (A et B) et dans le tissu adipeux (C et D). La stéatose hépatique est quantifiée par un marquage à l’huile rouge (E).
Tous ces résultats pris ensemble établissent un lien fort entre HMGB1, la physiologie hépatique et le métabolisme énergétique. Mais sur la base de ces résultats encourageants, plusieurs questions restent en suspens pour comprendre la biologie et le rôle fonctionnel d’HMGB1 dans l’hépatocyte et dans le sang au cours du stress métabolique.
0 2 4 6 8 1 0 E m r 1 P tp r c p = 0 .0 7 E x p re s s io n /3 6 b 4 ( a .u ) V e h IC M 0 5 1 0 1 5 2 0 C o l1 a 1 p = 0 .0 7 A c t a 2 E x p re s s io n /3 6 b 4 ( a .u ) V e h IC M 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 E m r 1 P tp r c * * * * E x p re s s io n /H p rt ( a .u ) V e h IC M 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 C o l1 a 1 * * * A c ta 2 E x p re s s io n /H p rt ( a .u ) V e h IC M HF D+ Ve h HF D+ ICM 0 2 4 6 8 * % o f p o s it iv e p ix e ls Veh ICM B. A. D. C. E.
96 Dans ce contexte, ce travail de thèse a trois objectifs principaux :
OBJECTIF I : Etude du rôle d’HMGB1 dans les hépatocytes au cours de la progression de la stéatose :
Dans le but d’étudier le rôle d’HMGB1 dans la physiologie hépatique et le métabolisme énergétique in
vivo, et compte tenu de la létalité du KO global de la protéine, nous avons généré un modèle murin
présentant une délétion du gène Hmgb1 spécifiquement dans les hépatocytes (HMGB1ΔHep). Les souris
contrôles HMGB1fl/fl et HMGB1ΔHep sont soumises à différentes modulations nutritionnelles afin de
mieux caractériser l’impact de la délétion d’HMGB1 sur la physiologie du foie.
OBJECTIF II : Etude du rôle biologique de la forme circulante d’HMGB1 au cours du stress métabolique :
Au cours du stress métabolique le rôle d’HMGB1 circulant est mal caractérisé et peu connu. Pour comprendre l’effet de cette molécule dans ce contexte nous avons mis en place des approches pharmacologiques reposant sur l’utilisation de deux inhibiteurs soit de l’activité cytokinique (la GLY) soit de la sécrétion active (les ICM) d’HMGB1 dans un contexte de stress métabolique. Comme décrit précédemment, un traitement par les ICM au cours d’un stress métabolique très court (Fig 31) a entrainé une diminution très encourageante des marqueurs inflammatoires dans le foie et le tissu adipeux. Pour aller plus loin dans cette caractérisation nous avons donc lancé plusieurs protocoles expérimentaux où des souris sauvages, sous régime hyper-lipidique, seront traitées avec ces deux inhibiteurs (ICM et GLY).
OBJECTIF III : Etude de la source tissulaire à l’origine de la forme circulante d’HMGB1 :
Comme déjà évoqué, au cours de la progression de l’obésité les concentrations circulantes d’HMGB1 sont augmentées chez la souris obèse mais aussi chez le patient obèse (Arrigo et al., 2013; Guzmán- Ruiz et al., 2014; Wang et al., 2015a). A l’heure actuelle le(s) tissu(s) impliqué(s) dans la production de ces taux circulants et dans l’augmentation observée au cours du stress métabolique sont inconnus. Compte tenu de l’inflammation de bas grade décrite, et du stress subi par les tissus métaboliquement actifs au cours de la progression de l’obésité, nous posons l’hypothèse que l’augmentation des taux circulants d’HMGB1 pourrait provenir des cellules les plus exposées au stress métabolique soit des hépatocytes, des adipocytes ou des macrophages. Pour étudier la contribution relative de ces types cellulaires dans les taux circulants d’HMGB1, nous avons mis en place des approches de délétions cellule-spécifique d’HMGB1 en utilisant la technologie CRE-Lox dans chacun de ces types cellulaires générant ainsi les lignées délétées spécifiquement dans les hépatocytes : HMGB1ΔHep, les adipocytes HMGB1ΔAdipo, et les macrophages HMGB1ΔMac.
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