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2.1. Question de recherche
Tel que indiqué dans les deux revues de littérature, les propriétés probiotiques de Propionibacterium
freudenreichii (Pf), dont l’effet immunomodulateur exercé par les protéines S-layer (Slps), sont
souche-dépendantes. L’étude de l’effet matrice sur le potentiel probiotique de P. freudenreichii reste peu exploré. Dans la perspective de développer des fromages dit «fonctionnels» fermentés par P.
freudenreichii, il est fondamental de comprendre comment la vectorisation par la matrice fromagère
influenceles propriétés probiotiquesde P. freudenreichii. Les études menées jusqu’à aujourd’hui nous ont permis d’avancer l’hypothèse que le potentiel immunomodulateur de P. freudenreichii sera modulé par la matrice fromagère, par comparaison à une culture liquide ; par le fait d’une une variation de la quantité vivante atteignant le côlon d’une part, et d’autre part par le fait d’une variation en termes de protéome de surface, en particulier les protéines Slps. En fonction de la matrice de vectorisation, l’activité métabolique in situ et donc la production de métabolites anti-inflammatoires sera modulée. La réponse immunitaire de l’hôte se fera également en fonction de la composition du protéome de surface. La question de recherche principale, objet de la thèse, est donc la suivante :
Comment la matrice fromagère impacte-t-elle les propriétés immunomodulatrices de P.
freudenreichii à travers ses protéines Slps ?
2.2. Objectif et stratégie
Le projet de thèse vise à déterminer l’impact de la matrice fromagère sur les propriétés probiotiques, en particulier les propriétés immunomodulatrices de P. freudenreichii et de ses protéines S-layer, pour une vectorisation vers le tube digestif. Nous avons fait le choix de travailler principalement sur une seule souche, Pf CIRM-BIA 129 ; il s’agit de la souche ayant le meilleur potentiel anti-inflammatoire in vitro et ayant été évaluée in vivo dans un modèle de colite murine (Foligné et al., 2010, 2013; Le Maréchal et al., 2015; Plé et al., 2015). De plus, dans la première partie du projet de thèse, nous avons fait le choix d’étudier l’effet de la matrice fromagère en utilisant un fromage monosouche développé précédemment (Plé et al., 2015), afin de s’affranchir des interactions qui peuvent exister entre P. freudenreichii et la
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flore microbienne d’un fromage emmental. La question de recherche a été déclinée en plusieurs sous-questions présentées sous forme de chapitres. Pour y répondre, différentes expérimentations ont été menées, s’inscrivant dans un schéma général de stratégie (Figure 6), détaillé ci-dessous :
1) Dans le chapitre 3, la question principale étudiée était : quel est l’effet de la matrice fromagère sur les propriétés immunomodulatrices de P. freudenreichii CIRM-BIA 129 lors de la digestion in vitro ? Pour cela, la tolérance aux stress digestifs de P. freudenreichii ainsi que la protéolyse des protéines de surface ont été comparées, entre une vectorisation par la matrice fromagère et une vectorisation par une culture sur l’ultrafiltrat de lait. Le modèle de digestion statique in vitro, ainsi que le modèle dynamique de digestion DIDGI® ont été utilisés.
Dans une démarche complémentaire, l’effet immunomodulateur des peptides issus de la protéolyse des protéines Slps sur des cellules épithéliales intestinales HT-29 a été déterminé, et il a été comparé à l’effet immunomodulateur exercé par P. freudenreichii CIRM-BIA 129 et des protéines Slps intactes.
2) Dans le chapitre 4, au vue des résultats in vitro, nous avons souhaité répondre à la question suivante : est-ce que la matrice fromagère module les propriétés immunomodulatrices in vivo de P. freudenreichii CIRM-BIA 129 ? Pour y répondre, l’effet de la matrice fromagère sur la protéolyse in vivo des Slpsen comparaison à une culture sur l’ultrafiltrat de lait a été recherché dans un modèle de porcelets. Ensuite, l’effet de la matrice fromagère sur l’activité métabolique in vivo ainsi que les propriétés immunomodulatrices de P. freudenreichii a été examiné chez les porcelets, par comparaison à une culture sur l’ultrafiltrat de lait. La réponse immunitaire des porcelets a été évaluée au niveau intestinal et au niveau systémique en termes de réponse cytokinique et de modulation des phénotypes des lymphocytes T. La réponse ex vivo des cellules immunitaires intestinales et systémiques a été également analysée en réponse à des stimuli pro-inflammatoires.
3) Dans le chapitre 5, nous avons souhaité explorer, comment le milieu de croissance influence-t-il la survie de P. freudenreichii CIRM-BIA 129 dans le milieu caecal ? Un milieu caecal a été préparé à partir des contenus caecaux récupérés lors de l’abattage des porcelets (Chapitre 4)
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afin de mimer l’environnement colique. Nous avons ainsi étudié la survie de P. freudenreichii, provenant de deux milieux de culture (YEL et ultrafiltrat de lait), en plus du fromage monosouche. Nous avons également étudié la survie de Pf en fonction de la protéolyse des protéines de surface afin de comprendre l’influence des protéines Slps sur l’adaptation de Pf au milieu caecal. De plus, nous avons étudié la survie de Pf et de Pf KO SlpB dans le milieu caecal. L’expression de novo des Slps a été également examinée.
4) Dans le chapitre 6, la question principale posée était : quel est l’effet d’un emmental « probiotique » dans un modèle de colite chimiquement induite chez la souris ? Dans cette perspective, nous avons souhaité évaluer des souches lactiques et propioniques anti-inflammatoires pour élaborer un emmental aux propriétés immunomodulatrices souhaitées. Nous avons sélectionné les souches : Pf CIRM-BIA 129, Streptococcus thermophilus LMD-9 et de Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CNRZ327. L’effet probiotique d’un fromage emmental a été évalué dans un modèle de colite murine, en le comparant à celui du fromage expérimental monosouche, précédemment testé (Plé et al., 2015).
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Figure 6. Schéma de la stratégie générale mise en œuvre lors du projet de thèse pour répondre à la question de recherche : « Comment la matrice fromagère impacte-t-elle les propriétés immunomodulatrices de P. freudenreichii à travers ses protéines Slps ? ». La question de recherche a été déclinée en sept questions intermédiaires de recherche s’intéressant aux effets probiotiques de P. freudenreichii CIRM-BIA 129 et de ses protéines Slps, suite à une vectorisation par la matrice fromagère. Le numéro de chapitre incluant les sous questions traitées est annoté sur la figure sous forme d’hexagones.
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