A expectativa de vida média da população está aumentando rapidamente, entretanto, a faixa etária dos 65 anos ou mais, está em ascensão (131). A partir desta faixa etária, as doenças cardiovasculares (DCV), dentre elas, o infarto agudo do miocárdio e acidente vascular cerebral (132, 133), aumentam de maneira significativa e são as causas mais comuns de mortalidade (134). Dentre os fatores de risco mais comuns nas DCV podemos citar hipertensão arterial, colesterol, sobrepeso/obesidade, tabagismo, sedentarismo e diabetes (135). Portadores de DM, apresentam hiperglicemia persistente, consequentemente levando um aumento na geração de MGO, um potente agente glicador intracelular relatado por contribuir nas complicações cardiovasculares (117). O diabetes exacerba a lesão cerebral induzida por acidente vascular cerebral, que está correlacionada ao MGO e a glutationa presente no sistema nervoso central. (136). Estudos com indução de diabetes tipo1 por estreptozotocina em camundongos demonstraram que cérebro de diabéticos são mais suscetíveis a ativação plaquetária e formação de trombos. O tratamento com N-acetilcisteína aumenta os níveis da glutationa plaquetária, melhorando a eliminação do MGO, corrigindo os níveis da glutationa peroxidade-1 e superóxido dismutase-1 (137). A produção de MGO em pacientes com DM encontra-se de duas a cinco vezes maior quando comparados com indivíduos não portadores, apresentando uma concentração plasmática de aproximadamente 0,40 mM, podem alcançar até 1,0 mM pós-prandial (105). Hadas e colaboradores (125), demonstraram que o MGO na concentração de 1,0 mM produz uma hiperagregabilidade plaquetária.
Assim, neste estudo, avaliamos o efeito do MGO na ativação plaquetária induzida por trombina, colágeno e U46619. A incubação prévia com MGO em plaquetas humanas lavadas potencializou a agregação induzida por trombina, colágeno e U46619, de maneira concentração- dependente. Dentre os agonistas, a trombina apresentou uma maior potencialização da agregação plaquetária, seguida do colágeno e U46619. A incubação da suspensão plaquetária com MGO (0,64 mM; concentração equivalente ao observados no plasma de pacientes diabéticos) aumentou em 60, 10 e 3 vezes, respectivamente, a agregação plaquetária para trombina 0,01 U/mL, colágeno 0,2 µg/mL e U46619 0,5 µM. Observamos também que suspensão plaquetária incubada com a menor concentração de MGO (0,08 mM) e ativada com trombina (0,03 e 0,1 U/Ml) ou colágeno (1,0 e
2,0 µg/mL) levou a potencialização da agregação; porém, tal potencialização não foi observada com o U46619 (0.25 a 2,0 µM).
O TXA2 atua como um mediador potente e amplificador da agregação plaquetária,
sendo este liberado em plaquetas ativadas com trombina e colágeno (134, 138).Em nosso estudo, os níveis aumentados de TXA2 em plaquetas ativadas por trombina e colágeno permaneceram
inalterados na presença de MGO, excluindo TXA2 como molécula intermediária no aumento da
agregação plaquetária.
Pacientes com DM tipo 2, submetidos ou não a um quadro de hiperglicemia aguda, apresentaram aumentos dos níveis circulantes do fator de Van Willebrand, da excreção urinária de TXB2, da P-selectina e da proteína lisossômica em plaquetas expostas ao estresse de cisalhamento in vivo e in vitro, demostrando que a hiperglicemia a curto prazo aumenta a ativação plaquetária. (139). Exposição aguda ao MGO levam a hemólise, danos ao DNA e perda de viabilidade celular em leucócitos, e inibição das atividades enzimáticas das plaquetas (NTPDase e ADA), demonstrando que o MGO é tóxico para as células sanguíneas (140).
Trabalhos com plaquetas humanas demonstraram que sistemas oxidantes externos às plaquetas são incapazes de ativar GP IIb/IIIa; entretanto, o aumento de ferro intraplaquetário está associado ao aumento de EROs citosólicas e ativação destes receptores (141). An e colaboradores (2012) (142) mostraram que a geração de EROs leva a danos oxidativos à ferritina bem como a perda de arginina, histidina e lisina, e aumento do teor de ferro nas células, sendo prejudicial às mesmas. Outros estudos in vitro com mioglobina de coração de cavalo, expostas ao MGO demostraram que há modificação de vários resíduos de lisina e arginina da mioglobina decorrente da incubação com MGO. Assim, acredita-se que AGEs derivados do MGO induzam alterações estruturais ou perda da proteína heme, indicando que os mesmos ajam como indutores da agregação de proteína (143).
Estudos mostram que a NOX2 é a principal proteína reguladora das respostas plaquetárias mediadas por EROs, como indicado pela presença das proteínas de membrana gp91phox e p22phox, assim como das subunidades citosólicas p47phox, p67phox e RAC (91). As plaquetas ativadas podem gerar uma variedade de EROs, incluindo O2-, H2O2, OH- e ONOO-, que
podem ser necessários para a ativação plaquetária máxima (144-147). O tratamento com MGO em artérias carótidas de rato aumentou a produção de O2- e H2O2, bem como aumentou a contração
significativamente os efeitos da MGO (148). De fato, concentrações elevadas de MGO no plasma de indivíduos diabéticos resultam em níveis elevados de EROs, piorando o quadro de DCV (116, 117, 124). Estudos de Monteiro et al., utilizando ratos alimentados com dieta hiperlipídica, também comprovaram a hiperagregabilidade plaquetária acompanhada de uma elevada produção de EROs (87), evidenciando o desequilíbrio entre a formação de EROs favorecendo a ativação plaquetária (149).
Em nosso estudo, avaliamos a produção de EROs em plaquetas ativadas pré-tratadas com MGO usando-se duas sondas, DCFH-DA e DHE, pelo método de citometria de fluxo. O DCFH-DA é o ensaio mais usado em plaquetas, mas devido às limitações desta sonda e geração potencial de artefatos, tem sido amplamente criticado (127). Recentemente, DHE combinado com citometria de fluxo tem sido descrito como técnica confiável e reprodutível para se detectar EROs em plaquetas humanas ativadas (128). Mostramos que, independentemente do método utilizado (DCFH ou DHE), o MGO eleva significativamente os níveis de EROs intraplaquetários independente do agonista plaquetário e do estado de ativação das plaquetas. Trombina e colágeno individualmente também elevaram os níveis de EROs, confirmando estudos anteriores com ambos agonistas (144, 150). No entanto, a pré-incubação com MGO não potencializou os níveis de EROs nas plaquetas ativadas, sugerindo que a produção máxima de EROs já foi alcançada com a incubação prévia com MGO, exceto, na ativação com trombina na concentração de 0,3 U/ml. Vale ressaltar que a medida de EROs, como aqui empregada, é mais qualitativa que quantitativa (151), representando assim uma limitação metodológica de nosso estudo. De qualquer modo, a incubação com o inibidor não específico de NOX, apocinina, normalizou os níveis basais elevados das EROs em todas as amostras de plaquetas, confirmando a participação da NOX como fonte de produção de EROs, dados coerentes com estudo prévio (129). Está bem estabelecido que a geração intracelular de EROs desempenha papel importante na sinalização intraplaquetária, geralmente amplificando a resposta plaquetária (144, 146, 151-153), apesar de dados opostos terem sido relatados. Nos ensaios de agregação plaquetária analisamos a atividade do MGO sobre o complexo NADPH oxidase, e observamos que a incubação prévia com apocinina preveniu significativamente a hiperagregabilidade plaquetária pelo composto antioxidante, confirmando um papel crítico das EROs neste fenômeno. Em conjunto, nossos dados indicam que a hiperagregabilidade plaquetária está intimamente ligada à produção aumentada de EROs intraplaquetário.
O NO derivado de células endoteliais exerce um efeito inibitório na função plaquetária pela ativação da via de sinalização NO-GCs-GMPc, impedindo a adesão e a agregação (154, 155). A GCs é uma enzima de transdução de sinal amplamente distribuída no organismo, responsável pela conversão do GTP em GMPc. Um dos principais pré-requisitos para que o NO ative a GCs é a presença do grupamento férrico na sua forma reduzida de Fe2+, onde sua oxidação ou perda a torna insensível ao NO (156). O GMPc promove suas ações por vários mecanismos levando à inibição plaquetária, incluindo diminuição da concentração do Ca2+ citosólico; inibição da geração de IP3; ativação de PKG, que fosforila o resíduo de serina 239 da VASP; e desfosforilação da cadeia leve da miosina (63, 154). A oxidação do grupamento heme da GCs pelo o ODQ torna essa enzima insensível à ativação ao NO, prevenindo a inibição plaquetária (75) e os relaxamentos vasculares e não vasculares do músculo liso (157-159).
Assim, avaliamos o efeito inibitório do SNP, doador de NO, em ensaios de agregação plaquetária induzida pela trombina, colágeno e U46619. O SNP inibiu significativamente a agregação plaquetária induzida pela trombina, colágeno e U46619, confirmando estudo prévio do grupo (126). No entanto, o MGO não modificou a ação inibitória do SNP na agregação plaquetária. Em aorta de camundongos diabéticos, o MGO inibiu a expressão de iNOS quando estimulada por IFN-y (interferon-gama) e LPS (lipopolissacarídeo), que foi prevenido pelo pré-tratamento de L- arginina, mostrando que MGO contribui para a disfunção vascular em diabéticos (160). Aorta torácica de ratos incubada com MGO apresentaram danos vasculares, os quais foram revertidas pelo tratamento com cinamaldeído (óleo derivado da canela) por mecanismo envolvendo estimulação da produção de NO, ampliando a vasodilatação (161).
Avaliamos as expressões proteicas das subunidades α1 e β1 da GCs e observamos que em plaquetas tratadas com MGO as expressões destas subunidades não foram alteradas. O próximo passo foi avaliar os níveis de GMPc gerados em plaquetas. Notamos que incubação prévia com MGO e ativação com trombina e colágeno não modificou os níveis basais de GMPc, nem tampouco afetou o aumento deste nucleotídeo induzido por SNP. Em conjunto, esses dados são sugestivos de que a via de sinalização GCs-GMPc em plaquetas não é alterada pelo MGO.
Vários mecanismos têm sido propostos para explicar os efeitos fisiopatológicos dos AGEs (112). Os AGEs ligam-se ao receptor de superfície celular RAGE, que é um membro da superfamília de receptores das imunoglobulinas de superfície celular que reconhecem ligantes endógenos derivados de patógenos e hospedeiros para iniciar respostas celulares, incluindo a
produção de EROs (162). No entanto, os eventos moleculares downstream do RAGE ativados por ligante são amplamente desconhecidos e podem incluir diferentes mecanismos em um único tipo de célula. Plaquetas humanas expressam RAGE (114, 115), mas há estudos sugerindo que MGO é permeável à membrana e por isso pode exercer seus efeitos independentement de ativação de RAGE (118, 163). Por isso, não podemos predizer no momento se a agregação plaquetária aumentada juntamente com a elevação dos níveis de EROs pelo MGO é resultado da ativação de RAGE na membrana plaquetária, ou de alteração das propriedades físico-químicas e funcionais da membrana (113).
Em resumo, nosso estudo mostra que MGO aumenta os níveis de EROs intraplaquetários e amplifica a agregação plaquetária humana induzida pela trombina, colágeno e U46619 por mecanismos independentes da inativação da sinalização NO-GCs-GMPc. Dessa forma, fármacos capazes de capturar o MGO produzido no organismo podem ser uma boa opção terapêutica visando redução das complicações da trombose relacionadas ao diabetes.