D-1-b Au niveau protéique :

Nous avons validé la qualité des transfections au niveau protéique en vérifiant la surexpression des protéines correspondantes dans les chondrocytes C-20/A4 transfectés par deux techniques :

• La cytométrie en flux.

• Le spectre différentiel redox du cytochrome b558

1. La cytométrie en flux

L’expression protéique a été déterminée en réalisant une expérience de cytométrie en flux sur les cellules transfectées ou non par le plasmide codant Nox4A-V5His, par le plasmide codant Nox4B-V5/His ou Nox2. Ces cellules ont été fixées puis perméabilisées au préalable puis incubées avec les différents anticorps d’intérêt comme décrit dans le chapitre matériels et méthodes. Pour l’expression de la protéine Nox2, nous avons utilisé comme anticorps primaire deux anticorps monoclonaux NL7 et 54.1 qui ont pour cible un épitope intra-cellulaire (Figure 44a). Tout d’abord, nous confirmons les résultats précédemment décrits en démontrant encore une fois, la présence de Nox2 dans les cellules sauvages C-20/A4.

De plus, nous montrons une augmentation faible mais significative de l’expression de Nox2 dans les cellules transfectées par le plasmide codant pour Nox2, en comparaison à l’expression retrouvée dans les cellules sauvages C-20/A4. Puis, nous démontrons l’expression protéique de Nox4, toujours en cytométrie en flux, en utilisant deux anticorps primaires polyclonaux : l’anticorps « 504 » dirigé contre la deuxième boucle intracellulaire de Nox4 (cf. chapitre matériels et méthodes.) et un anticorps anti-histidine du commerce marquant l’étiquette polyhistidine C-Terminale. Nous confirmons tout d’abord la présence de la protéine Nox4 dans les cellules natives C-20/A4 comme précédemment décrit. Les résultats montrent aussi une augmentation significative de l’expression de Nox4A et Nox4B dans les lignées transfectées par le plasmide codant respectivement pour la protéine Nox4A-V5/His et Nox4B-V5/His (Figure 44b). Il faut noter une expression protéique de Nox4B-V5/His supérieure à celle de Nox4A-V5/His alors qu’au niveau transcriptionnel les résultats montent une quantité d’ARNm de Nox4A-V5/His supérieure à celle de Nox4B-V5/His (Figure 43). Cette différence pouvant peut-être s’expliquer par une stabilité plus grande de la transfection pour Nox4B-V5/His ou un niveau de traduction différent de l’ARNm.

Figure 44 Expression protéique de Nox2 et Nox4 par cytométrie de flux (a) Analyse par FACS de l’expression de gp91phox.

5x105 cellules C-20/A4 sauvages ou transfectées par le gène codant Nox2 sont fixées par 1% (p/v) de paraformaldehyde et incubées avec un anticorps primaire monoclonal anti gp91phox ( NL7 ou 54.1), après avoir été perméabilisées par de la saponine comme décrit dans le chapitre matériels et méthode. Les anticorps secondaires sont conjugués avec de la phycoérythrine (dilution 1:200). Les cellules incubées avec les anticorps non immuns et les cellules non marquées sont représentées respectivement par une ligne noire pleine (5µg/5x105cellules), et la zone grise pleine. Enfin les cellules C-20/A4 sauvages et les chondrocytes C-20/A4 Nox2 sont représentés respectivement par une ligne pointillée noire et une ligne noire pleine et grasse.

(b) Analyse par FACS de l’expression de Nox4

5x105 C-20/A4 sauvages ou transfectées par les gènes codant Nox4A-V5/His ou Nox4B-V5/His sont fixées par 1% (p/v) de paraformaldehyde et incubées avec un anticorps primaire monoclonal Nox4 ou anti-histidine après avoir été perméabilisées par de la saponine comme décrit dans le chapitre matériels et méthodes Les anticorps secondaires sont conjugués avec de la phycoérythrine (dilution 1:200). Les cellules incubées avec les anticorps non immuns et les cellules non marquées sont représentées respectivement par une ligne noire pleine (5µg/5x105cellules),et la zone grise pleine. Enfin les cellules C-20/A4 sauvages, les chondrocytes C-20/A4 Nox4A-V5/His et Nox4B-V5/His sont représentées respectivement par une ligne pointillée noire , une ligne grise pleine et une ligne noire pleine et grasse.

2. Le spectre différentiel redox du cytochrome b

Pour confirmer ces résultats et valider par une autre technique la transfection par le plasmide codant pour Nox4A dans la lignée C20/A4 Nox4A-V5/His, nous avons comparé les spectres différentiels redox d’extraits Triton 1% de membranes de chondrocytes sauvages avec le spectre différentiel redox d’extraits Triton 1% de membranes de la lignée C20/A4 Nox4A-V5His (transfectée par Nox4A). Nous avons utilisé comme témoin positif le spectre d’un extrait Triton 1% de cytochrome b558 issus de PMN humains.

Figure 45 Expression protéique de Nox4 par spectres redox différentiels du cytochromeb558

Le spectre différentiel redox de l’extrait triton 1% des membranes des chondrocytes C20/A4 sauvages (ligne grise b), des menbranes de la lignée transfectée par le plasmide codant pour Nox4AV5/his (ligne grise c) a été réalisé comme décrit dans le chapitre matériels et méthodes. Le spectre différentiel redox de l’extrait triton 1% du cytochrome b558 issu de PMN humains (ligne noir a) a servi de témoin positif. La quantité du cytochrome b558 réduit est déterminée par l’absorbance à 426 nm utilisant une valeur de ε426 nm exprimée en 106 mM-1 /cm-1 ou à 558 mn (ε_{558 nm} =21.3 mM-1. cm-1). L’absorbance du cytochrome b558 purifié à partir de PMN humains est lue sur l’échelle de gauche en ordonnée alors que l’absorbance des membranes des lignées chondrocytaires est lue sur l’échelle de droite en ordonnée

Ainsi les résultats montrent que le spectre différentiel redox du cytochrome b558 de PMN présente trois pics d’absorption caractéristiques du cytochrome b558 à 426nm, 530 et 558 nm. De plus, le spectre d’absorption démontre une expression de Nox4 dans les chondrocytes de la lignée sauvage en mettant en évidence un pic de faible amplitude caractéristique à 426 nm, tout comme les PMN. Ce pic est aussi retrouvé dans les chondrocytes de la lignée transfectée par le plasmide codant pour Nox4A. Par ailleurs d’un point de vue quantitatif, si on compare le spectre des chondrocytes des lignées sauvages et transfectées nous observons une augmentation significative de l’expression de Nox4 dans la lignée transfectée (Figure 45). Nous validons donc tant sur le plan transcriptionnel que protéique la qualité de la transfection des plasmides codant aussi bien pour Nox2, Nox4 A et B dans les chondrocyte C20/A4. Nous allons maintenant nous intéresser à l’impact sur un plan plus fonctionnel de ces transfections sur la capacité qu’ont ces cellules à engendrer un stress oxydatif.

III-D-2 Impact sur l’activité NAD(P)H oxydase des lignées