La nitrate réductase périplasmique

La nitrate réductase périplasmique Nap est le premier type de nitrate réductase dissimilatoire que l’on retrouve chez les bactéries (Figure 2.1.B). Cette enzyme est liée à la membrane cytoplasmique de la cellule et tournée vers le périplasme (Sparacino- Watkins et al., 2014). Cette enzyme est généralement associée à la respiration anaérobie, bien que la validité de cette affirmation soit débattue. En effet, afin de produire de l’énergie, un gradient de protons doit se créer entre le périplasme et le cytoplasme. Le gradient électrochimique ainsi créé peut être exploité par les ATP synthases afin de créer de l’ATP. Le complexe receveur d’électron (Nap) et le donneur d’électron (e.g. formate déshydrogénase) se trouvant tous les deux dans le périplasme, aucun gradient de protons n’est créé lors de la réduction du nitrate en nitrite car les protons produits sont tout de suite consommés par réaction de réduction (Jepson et al., 2007). Cependant, il a été montré qu’un tel gradient peut néanmoins se former si la réduction du nitrate est couplée avec l’oxydation du formate (Kern et al., 2009). De manière générale, de nombreuses bactéries utilisent le système Nap afin de faire la respiration anaérobie du nitrate ou pour encourager la dénitrification. Nap a été isolée et purifiée pour la première fois chez Paracoccus denitrificans en 1993 et par la suite dans une grande variété de bactéries (Sears et al., 1993, Sparacino-Watkins et al., 2014). Cette enzyme est constituée de trois sous-unités NapABC dont les gènes sont compris dans un même opéron napABC (Richardson et al., 2001). NapAB forme le complexe catalytique localisé dans le cytoplasme qui est associé avec NapC, protéine transmembranaire ancrée dans la membrane cytoplasmique. NapA est la sous-unité catalytique possédant un cluster [4Fe-4S] alors que NapB est un cytochrome c552 à

dihème faisant le transfert des électrons jusqu’à NapA (Breton et al., 1994). Des études structurales de NapA ont montré des différences au niveau du cycle catalytique de l’enzyme entre les bactéries Desulfovibrio desulfuricans et Rhodobacter capsulatus (Van Spanning et al., 2005). Bien que cette différence puisse être due aux méthodes différentes utilisées dans les deux études, il se peut qu’il existe différentes façons de réaliser le cycle catalytique de l’enzyme, notamment au niveau de la coordination de l’oxygène du Mo pendant le cycle catalytique. NapC s’ancre dans la membrane cytoplasmique grâce à une hélice transmembranaire située en N-terminal avec quatre hèmes de type c (Roldán et al., 1998). Son domaine périplasmique prend en charge le transfert des électrons provenant du pool de quinols situé dans la membrane jusqu’au

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complexe catalytique NapAB (Cartron et al., 2002). Les deux électrons nécessaires à la réduction du nitrate en nitrite sont transférés par le biais des hèmes présents chez NapB et du cluster [4Fe-4S] de NapA pour arriver au site catalytique avec bis-MGD de NapA, catalysant la réaction de réduction.

Excepté Shewanella putrefaciens et Campylobacter jejuni, toutes les bactéries possédant une nitrate réductase Nap ont en commun les gènes napABCD réunis dans un opéron (Van Spanning et al., 2005). Ces deux bactéries ne possèdent pas de napC, mais étant donné le rôle primordial joué par NapC, il a été avancé qu’une autre protéine ayant des propriétés équivalentes et située autre part dans le génome devait être utilisée par ces bactéries. NapD, qui est conservée dans tous les opérons nap, a un rôle de chaperonne et participe à l’assemblage des différentes sous-unités (Potter et al., 1999a). Par la suite, il est possible de retrouver différents gènes additionnels (napKEFGH) compris dans l’opéron nap mais leurs positions et leurs apparitions diffèrent selon les espèces (Van Spanning et al., 2005). De plus, ces protéines ne semblent pas jouer de rôles essentiels dans la réduction du nitrate par Nap (Potter et al., 1999a). Selon la combinaison des gènes présents dans l’opéron, on peut classer les opérons nap dans trois catégories. Dans la première, napGH est présent mais napE est absent. Les rôles sont inversés dans la deuxième catégorie où napGH est absent et

napE présent. Finalement la troisième catégorie est définie par l’absence de ces gènes

(Van Spanning et al., 2005). Quoi qu’il en soit, il semble qu’il y ait une corrélation entre l’organisation de l’opéron et la physiologie de la bactérie et/ou même du devenir du nitrite produit (Potter et al., 2001). Il a été avancé également que les gènes absents de l’opéron nap pourraient être remplacés par des gènes situés autre part dans le génome ayant une fonction similaire. La fonction de NapE et NapK reste inconnue à ce jour, ces deux gènes codant pour des protéines membranaires en petites hélices simples. Peu d’informations sont disponibles pour NapF et NapG également. NapF pourrait être localisée dans le cytoplasme, contrairement à NapG, qui semble être destinée au périplasme, car un signal de transport pour le périplasme est présent dans sa séquence. NapH est ancrée à la membrane avec ses extrémités C et N faisant face au cytoplasme. Elle possède les mêmes motifs que NapF et NapG sur son domaine C-terminal. Les caractéristiques structurales de NapGH suggèreraient un rôle dans l’oxydation de l’ubiquinol chez E. coli (Brondijk et al., 2002). Les centres métalliques du complexe NapHGC fourniraient les deux électrons à NapAB grâce à l’oxydation de deux molécules du pool de quinole UQH2 (ubiquinoles), ce qui a pour effet de transférer deux protons

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A

B

C

Figure 2.1 : Représentation des différentes sous-unités de (A) la nitrate réductase assimilative, (B) la

nitrate réductase périplasmique et (C) la nitrate réductase membranaire. Modifié de Gonzalez et al. (2006)

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H+ _{du cytoplasme vers le périplasme (Gonzalez et al., 2006). De plus, le transfert}

d’électrons entre NapG et NapC entrainerait également le transfert de deux protons du cytoplasme vers le périplasme, pour un total de quatre protons transférés (Brondijk et

al., 2004). Ainsi la réduction d’une molécule de nitrate par Nap contribuerait quand

même à l’établissement du gradient de proton malgré les deux protons consommés par Nap pour la réduction du nitrate. Une deuxième voie possible serait que le transfert d’électrons vers NapAB ne serait pris en charge que par NapC chez les organismes ne possédant ni NapG ni NapH. Cependant, les électrons fournis proviendraient du pool de MQH2 (menaquinols) car Nap est incapable d’utiliser UQH2 (Brondijk et al., 2004). Dans

ce cas-ci, seuls deux protons sont transférés dans le périplasme et consommés pour la réaction de réduction, ne produisant aucun gradient de protons. Les organismes concernés utilisent alors la réduction du nitrate pour consommer des électrons et réduire une potentielle accumulation dans le cytoplasme d’équivalents de réduction comme le NADH et le FADH2 (Gonzalez et al., 2006).