Par PCR, nous avons isolé le cadre de lecture ouvert de 573pb nommé YDR373w (par la suite yeNCS-1) codant pour la protéine yeNCS-1, flanqué en amont par une séquence 5’non-traduite de 633pb et en aval par une séquence 3’non-traduite de 174pb. Une construction plasmidique linéarisée comportant ces régions non-traduites autour du gène de résistance à la kanamycine au lieu du gène de yeNCS-1 a ensuite été transformé dans une souche sauvage de levure. Après un événement de recombinaison homologue, la souche hétérozygote résultante yencs1∆::KanR / yeNCS-1 a ensuite été sporulée et les asques dissequés. Sur quatres spores, seules deux étaient viables indiquant que yeNCS-1 est un gène vital pour la croissance de la levure.
NCS-1 humain peut se substituer à yeNCS-1
Nous avons ensuite transformé l’hétérozygote yencs1∆::KanR / yeNCS-1 avec un plasmide comportant l’ADNc du gène humain de NCS-1 (huNCS-1). Toutes les quatre spores issues de la sporulation et dissection étaient capable de croître normalement suggérant qu’une copie vertébrée de NCS-1 peut se substituer au gène de la levure, indiquant une fonction conservée pour NCS-1 du point de vue de l’évolution.
La fonction de yeNCS-1 est-elle Ca2+-dépendante ?
Sur la base d’observations faites sur la troponin C (Putkey et al., 1989), nous avons construit par PCR un mutant ponctuel de NCS-1 incapable de lier le Ca2+. Ce double-mutant nommé yeNCS-1(2D-A) possède en effet les deux substitutions D109A dans EF3 et D157A dans EF4. Pour vérifier que ces deux mutations suffisent à rendre yeNCS-1 inapte à lier les ions Ca2+, nous avons inséré le gène sauvage ou mutant de yeNCS-1 dans un vecteur d’expression inductible bactérien (pGEX-6-P3) dans le but de produire et purifier les protéines de fusion GST-yeNCS-1 (sauvage) et GST-yeNCS-1(2D-A) (mutant). Une fois séparées par SDS-PAGE et transférées sur une membrane de nitrocellulose, seule GST-yeNCS-1 a pu garder sa capacité de lier le Ca2+
comme mis en évidence par incubation avec du 45Ca2+ et autoradiographie de la membrane. Ceci confirme que le mutant yeNCS-1(2D-A) est bien déficient pour sa liaison au Ca2+.
Nous avons ensuite transformé l’hétérozygote yencs1∆::KanR / yeNCS-1 avec un vecteur d’expression portant le gène du mutant yeNCS-1(2D-A). Suite à la sporulation et la dissection, toutes les quatres spores étaient capable de croître normalement suggérant que la fonction essentielle de yeNCS-1 n’est pas dépendante du Ca2+. La mesure de la densité optique de cultures en milieu liquide, nous a permis de calculer le taux de croissance des souches exprimant soit le type sauvage, soit le double mutant 2D-A, soit la version humaine de NCS-1. Tous ont des taux de croissance indifférentiables, indiquant que la vitesse de croissance n’est pas médiée une par une signalisation via Ca2+/yeNCS-1 tant en milieu solide que liquide et à des taux d’expression de yeNCS-1 tant élevés que bas.
Nous avons mesuré par comptage visuel les taux de sporulation des souches exprimant soit le type sauvage, soit le double mutant 2D-A, soit la version humaine de NCS-1. Toutes les souches ont un taux de sporulation comparables, seul la souche exprimant huNCS-1 possède un taux légèrement affaibli.
Une expérience reconnue pour mesurer la capacité sécrétoire chez S.cerevisiae, est la mesure du rapport entre l’activité extracellulaire et l’activité totale de l’enzyme β -D-fructofuranoside-fructohydrolase (communément appelée invertase) qui nous fournit un index de sécrétion. Cette expérience avait déjà permis de démontrer un rôle dans la sécrétion joué par PIK1, un partenaire potentiel de yeNCS-1 (Hama et al., 1999). Nous avons donc comparé les indices de sécrétion des diploïdes sauvage (WT) avec l’hétérozygote yencs1∆::KanR / yeNCS-1 ainsi que les haploïdes yencs1∆::KanR transformés avec un vecteur d’expression portant soit une copie sauvage du gène yeNCS-1, soit la version mutante yeNCS-1(2D-A), à des taux d’expression de yeNCS-1 tant élevés que bas.Aux deux températures testées (30 et 37°C), le nombre de copies de yeNCS-1 n’a pas eu d’influence sur la capacité sécrétoire de la cellule. De même, le mutant qui n’est pas capable de lier le Ca2+ ne s’est pas révélé différent du type sauvage. Ainsi, la signalisation médié par Ca2+/yeNCS-1 n’est pas requise pour la sécrétion de l’invertase chez la levure.
Quelles sont les cibles de yeNCS-1 ?
Dans le but d’identifier des cibles de yeNCS-1 autres que PIK1 mais aussi pour confirmer l’interaction physique de yeNCS-1 et PIK1, nous avons produit dans E.coli les protéines recombinantes de fusion GST (comme contôle), GST-yeNCS-1 et GST-yeNCS-1(2D-A). Ces
protéines ont ensuite été purifiées au moyen de billes de sépharoses couvertes de glutathione, le substrat de GST (glutathione-S-transferase). Leur pureté a été vérifiée par SDS-PAGE et coloration Coomassie. Ces billes liées à l’une des trois protéines de fusion ont ensuite été incubée avec un extrait protéique total d’une souche sauvage de S.cerevisiae. Au cours de cette incubation, une protéine cible de NCS-1 devrait être pêchée ("pull-down") par GST-yeNCS-1 liées aux billes et résister aux étapes de lavage. Si cette interaction est Ca2+-dépendante alors la protéine cible ne devrait pas se lier aux billes couplées à GST-yeNCS-1(2D-A).
Pour identifer les protéines liées à GST, GST-yeNCS-1 et GST-yeNCS-1(2D-A), nous les avons séparé par SDS-PAGE à deux dimension, visualisé par coloration Coomassie. Les protéines colorées ont ensuite été excisées du gel, digérées à la Trypsine résultant pour chacune des protéines en une mixture de peptides spécifiquement et individuellement identifiable par spectrométrie de masse MALDI-TOF ("matrix-assisted laser desorption ionization time of flight", voir Experimental Procedure) et comparaison in silico avec toutes les séquences codantes de S.cerevisiae.
Nous avons analysé les protéines de fusion GST, GST-yeNCS-1 et GST-yeNCS-1(2D-A) seuls (sans incubation avec l’extrait de levure) dans une première étape, et dans une seconde étape les mêmes protéines recombinantes incubées avec l’extrait protéique de levure. Séparément, l’extrait total de levure a aussi été analysé. Les Tables 4.A à 4.F présentent la liste complète des protéines identifiées sur les gels des Figures 22.A à 22.F. Comme attendu, GST et yeNCS-1 ont été identifiées sur les trois gels "seuls". En revanche, sur les gels issus du "pull-down", yeNCS-1 n’a été identifié que sur le gel du mutant GST-yeNCS-1(2D-A). De plus ni GST ni PIK1 n’ont été identifiés lors du "pull-down" avec l’une des trois protéines de fusion.
Conclusion Partie 1
Nous avons montré que le gène codant pour yeNCS-1 est vital pour la levure et que NCS-1 d’origine humaine peut remplacer cette fonction essentielle. Cependant, nous avons pu constater que ce rôle essentiel de yeNCS-1 n’est pas Ca2+-dépendante dans les conditions testées. En effet, la double-mutation 2D-A, qui rend impossible la liaison du Ca2+, n’affecte ni la croissance, ni le taux de croissance, ni l’efficacité de sporulation qui est pourtant régulée par le Ca2+ via la calmoduline. Ceci est en contradiction avec une récente étude démontrant une dépendance au Ca2+ pour la croissance à haute température 37°C (Strahl et al., 2003). Chez la levure, le Ca2+ est spécifiquement requis pour la fusion de vésicules avec l’appareil de Golgi (Davis, 1995). PIK1, qui a été directement impliquée dans la sécrétion au niveau du Golgi (Hama et al., 1999, Walch-Solimena and Novick, 1999) a été désignée comme cible interagissant avec yeNCS-1 (Hendricks et al., 1999) nous amenant à penser que yeNCS-1 pourrait jouer un rôle dans la sécrétion. Dans nos conditions expérimentales, la capacité sécrétoire de la levure n’a pas pu être corrélée à la signalisation par Ca2+/yeNCS-1. Cependant, puisque l’interaction avec PIK1 n’est pas Ca2+ -dépendante (Huttner et al., 2003), une fonction Ca2+-indépendant pour yeNCS-1 dans la sécrétion n’est pas à exclure.
L’approche protéomique pour l’identification d’autres partenaires de yeNCS-1, le "GST pull-down" combiné au "MALDI-TOF MS" est une approche similaire déjà employée pour l’identification de cibles de la neurocalcin δ (Ivings et al., 2002). Pourtant, l’interprétation de nos résultats est rendue extrêmement difficile par la non-identification de PIK1 (et parfois aussi GST et yeNCS-1), la seule cible documentée qui nous aurait permis de valider notre approche. Même si elle a été démontrée par immunoprécipitation, on peut se demander si l’interaction PIK1-yeNCS-1 est suffisamment stable pour cette expérience. Des protéines de pI et de poids moléculaire comparable à ceux de PIK1 ont été identifiées dans nos conditions, écartant un problème de résolution des gels 2D. D’autres protéines candidates susceptibles d’interagir avec
yeNCS-1 ont été identifiées dans une expérience de "deux-hybrides" à grande échelle (Hazbun et al., 2003); parmi ces cinq cadres de lecture (ORF) aucun n’a été identifiée dans notre "GST pull-down". Récemment, il a été suggéré que chez Schizosaccaromyces pombe spNCS-1 est peut-être lié à une cascade de signalisation en provenance d’un récepteur couplé à la protéine G via l’adenylate cyclase, l’AMPc et la protéine kinase A. Ainsi, les auteurs indiquent que spNCS-1 pourrait coupler un signal calcique à une cascade issu de protéine G en favorisant la désensitisation du récepteur (Hamasaki-Katagiri et al., 2004) de manière comparable à la régulation de la rhodopsine par la recoverine. yeNCS-1 pouvant se substituer à spNCS-1 il est tentant de penser qu’un tel mécanisme serait conservé chez toutes les levures et chez les vertébrés aussi, puisque NCS-1 régule GRK1.
Pour conclure, puisque NCS-1 est susceptible d’interagir avec de nombreuses cibles potentielles, à l’instar de la calmoduline et tout comme chez S.pombe, NCS-1 est probablement multifonctionnelle chez la levure.Cependant d’autres étude sont nécessaires pour caractériser précisément les fonctions de yeNCS-1 et éventuellement les extrapoler aux vertébrés. Ces expériences pourraient inclure:
Des expériences "deux-hybrides" pour détecter les cibles de NCS-1 dans la levures et chez les vertébrés en employant yeNCS-1, huNCS-1, NCS-1 mutants (qui ne lie pas le Ca2+) comme appât, et des librairies génomique de levure mais aussi de système nerveux central de vertébrés.
Localisation subcellulaire de yeNCS-1 et ses mutants avec des marqueurs fluorescents, ou par microscopie électronique pour detecter un changement de localisation Ca2+-dépendant et une colocalisation avec des cibles potentielles.
Optimisation du "GST pull-down" en utilisant des extraits protéiques issus de différentes fractions cellulaires, ou en remplaçant GST par des marqueurs/épitopes plus petits (HAM, Flag, Histidine) situés soit en N-terminal soit en C-terminal afin d’écarter une éventuelle interférence stérique due à GST.
La production d’un mutant thermosensible de yeNCS-1 (et ses mutants) ou de huNCS-1 nous fournirait un outil génétique pour la caractérisation des fonctions de yeNCS-1 et sa régulation de protéine cible en réponse à des signaux calciques.
Des expériences employant la RT-PCR quantitative nous permettraient de mesurer les niveaux d’expression de yeNCS-1 en réponse à des fluctuations de [Ca2+]i.
Partie 2: Délétion de NCS-1 chez la souris