Mutation du site de fixation du facteur de transcription YY1

La fréquence de l’initiation de la transcription du gène luciférase pourrait être ralentie par la présence d’un ou de plusieurs sites de fixation de répresseurs transcriptionnels dans la portion bactérienne du plasmide. YY1 est un facteur de transcription qui se comporte comme un répresseur transcriptionnel dans la plupart des gènes de mammifères ayant un site YY1 dans leur promoteur. Un site consensuel YY1 se trouve en amont du gène luciférase, il s’est agit de déterminer si YY1 réprime ou active le gène luciférase en interagissant avec les facteurs de transcription, qui se fixent sur le promoteur et l’amplificateur du CMV.

Dans une première étape, un oligonucléotide formant une structure en épingle à cheveux et contenant la séquence consensuelle de YY1 a été mis au point pour piéger le facteur de transcription dans les cellules épithéliales respiratoires nasales (Figure 19). La séquence YY1 contenant des liaisons phosphodiesters a été entourée de séquences riches en GC, afin de stabiliser la structure en épingle à cheveux. Une boucle de trois thymines a permis à l’oligonucléotide de se replier sur lui-même et de former une structure double brin pouvant fixer la protéine YY1. Les régions riches en GC et la boucle de thymines ont été stabilisées vis-à-vis des nucléases par des liaisons phosphorothioates. Un oligonucléotide contrôle a été mis au point selon les mêmes principes, afin de déterminer si l’effet de l’oligonucléotide YY1 a été spécifique de la séquence YY1. La séquence centrale a été brouillée : CGCCATGTT a été remplacé par TATTGCCGC.

Figure 19 Structure de l’oligonucléotide d’ADN YY1. La séquence consensuelle YY1 (CGCCATNTT) a été encadrée de trinucléotides riches en GC et contenant des liaisons phosphorothioates (astérisques).

Le plasmide pNGVL3-luc a été administré aux souris avec une dose croissante

d’oligonucléotide YY1 dans de l’eau. L’activité luciférase a augmenté en moyenne de 2,5 fois à 1 µg d’oligonucléotide et jusqu’à 9,5 fois à 10 µg d’oligonucléotide YY1 par souris. Par contre, l’expression luciférase n’a pas significativement augmenté avec 10 µg

d’oligonucléotide dont la séquence a été brouillée (Figure 20).

D’après ces résultats, le piégeage de YY1 avec l’oligonucléotide a réussi à améliorer l’expression du transgène. Soit YY1 ne s’est plus fixé sur sa séquence en amont du gène luciférase et n’a plus réprimé ce dernier, soit YY1 ne s’est plus fixé sur sa séquence située dans la région régulatrice de nombreux gènes cellulaires et cela a indirectement amélioré l’expression du gène luciférase.

5’

G*G*G*CGCCATGTT*G*C*G*

3’

C*C*C*GCGGTACAA*C*G*C* T T T

*

*

1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07

0 1 2 5 10 séquence

mélangée Dose de l'oligonucléotide YY1 par souris (microgrammes)

Activité luciférase (URL/mg protéine)

Figure 20 Transfection de l’épithélium nasal avec pNGVL3-luc et l’oligonucléotide YY1.

L’épithélium respiratoire a été perfusé avec 100 µg de plasmide, 1 à 10 µg d’oligonucléotide YY1 et 10 µg d’oligonucléotide à séquence brouillée dans de l’eau pure (n = 3-4 souris par groupe). ⁺⁺ P<0,01 ; ** P<0,005 ; ⁺⁺⁺ P<0,001 et *** P<0,0005 par rapport au plasmide seul.

séquence brouillée

Pour différentier un effet direct d’un effet indirect de l’oligonucléotide YY1 sur l’expression du gène luciférase, la séquence YY1 en amont de l’amplificateur transcriptionnel du CMV a été mutée de manière ciblée. La séquence CGCCATGTT a été mutée de manière à créer un site de restriction Not I (séquence soulignée) : CGCGGCCGC, afin d’identifier les plasmides mutants des plasmides sauvages après mutagenèse.

Brièvement, un oligonucléotide mutagène de 70 résidus a été utilisé pour muter le site YY1.

Les températures de son appariement au plasmide et de son repliement ont été calculées : 78,5˚C et 51,8˚C, respectivement. La différence de près de 27˚C entre ces deux températures a permis l’appariement de l’oligonucléotide mutagène à sa cible sur le plasmide avant son repliement. Le plasmide a d’abord été dénaturé par la soude, afin de séparer les deux brins d’ADN et permettre à l’oligonucléotide mutagène de s’apparier à sa séquence

complémentaire. L’appariement de ce dernier a eu lieu en chauffant le mélange plasmide dénaturé/oligonucléotide mutagène à 80˚C et en le refroidissant lentement jusqu’à 37˚C. Puis, l’oligonucléotide mutagène apparié à sa séquence complémentaire a servi d’amorce à l’ADN polymérase T4, qui a synthétisé les 5540 paires de base restantes. Après digestion avec Dpn I, la souche bactérienne BMH 71-18 mutS a été transformée avec les produits de la mutagenèse, suivie de la souche DH5α . Le plasmide d’une dizaine de colonies a été extrait et purifié et l’enzyme de restriction Not I a été utilisée pour identifier les plasmides ayant un seul site Not I (plasmides sauvages) et les plasmides ayant deux sites Not I (plasmides mutants). Un des plasmides mutants a été sélectionné et amplifié (cf. Matériels et Méthodes pour plus de détails).

Un des plasmides mutants a été dissout dans de l’eau et l’épithélium nasal de souris CD1 a été perfusé avec ce plasmide et pNGVL3-luc. L’activité luciférase a diminué de 3,7 fois avec le plasmide muté par rapport au plasmide sauvage (Figure 21).

1,0E+03 1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06

plasmide sauvage plasmide mutant

Activité luciférase (URL/mg protéine)

Figure 21 Transfection de l’épithélium nasal avec pNGVL3-luc et un plasmide mutant. La séquence YY1 en amont du gène luciférase a été mutée et remplacée par un site de restriction Not I. Cent µg de chaque plasmide ont été administrés à 3-4 souris CD1 par groupe. ***

P<0,0005 par rapport au plasmide sauvage.

Cette diminution de l’expression du gène luciférase suggère que le facteur de transcription YY1 se comporte comme un activateur transcriptionnel dans le contexte du

promoteur/amplificateur du CMV. Bien que YY1 ne soit pas un répresseur transcriptionnel, il est possible que des sites de fixation de véritables répresseurs transcriptionnels soient présents dans la partie bactérienne du plasmide ou dans la région régulatrice du transgène. En effet, Chao et al. ont identifié des sites de fixation du répresseur PDX1 dans le promoteur IE1 du CMV, qui affectent l’expression du transgène dans le pancréas [20].