H. Etude des intermédiaires de métabolisme
II- Mutation et sélection des mutants
II.1. Incubation des mutants par un agent mutagène chimique (Ethyl Methane Sulfonate - EMS)
II.1.1. Préparation de la suspension
Ensemencement d’un milieu complexe liquide avec la souche isolée et sélectionnée (on ensemence trois (03) erlens contenant chacun le milieu complexe liquide plus la souche proposée).
On incube dans un shaker (bain Marie avec agitation) à 30°C pendant 24 heures (voir figure n°15).
On prend 20 ml de chaque erlen
sédiments sont lavés avec du tampon phosphate à pH 7,2 puis on centrifuge une 2 2500 tr/mn pendant 10 mn.
Après ajout du milieu stérile, on incube pendant 2 heures.
La composition du tampon phosphate est la suivante (GASSER, 1966 et al., 1996). NaCl Na2HPO4 NaHPO4, Eau distillée
II.1.2. Induction proprement dite (Mise en contact avec l’agent mutagène
Après incubation, la suspension est mise en contact avec l’agent mutagène (EMS à 0,05 M), agitée à l’aide d’un agitateur magnétique pendant une minute puis incubée à 30°C pendant 18 heures.
Figure n°15: Incubation sur Shaker
On prend 20 ml de chaque erlen qu’on centrifuge à 2500 tr/mn pendant 10 mn, les sédiments sont lavés avec du tampon phosphate à pH 7,2 puis on centrifuge une 2
2500 tr/mn pendant 10 mn.
Après ajout du milieu stérile, on incube pendant 2 heures.
La composition du tampon phosphate est la suivante (GASSER, 1966
8, 5g. 1, 28g.
H2O 0, 14g.
Eau distillée 100 ml.
pH = 7, 2
Induction proprement dite (Mise en contact avec l’agent mutagène
Après incubation, la suspension est mise en contact avec l’agent mutagène (EMS à 0,05 M), agitée à l’aide d’un agitateur magnétique pendant une minute puis incubée à 30°C
76 qu’on centrifuge à 2500 tr/mn pendant 10 mn, les sédiments sont lavés avec du tampon phosphate à pH 7,2 puis on centrifuge une 2ème fois à
La composition du tampon phosphate est la suivante (GASSER, 1966 ; BOURGEOIS
Induction proprement dite (Mise en contact avec l’agent mutagène : EMS)
Après incubation, la suspension est mise en contact avec l’agent mutagène (EMS à 0,05 M), agitée à l’aide d’un agitateur magnétique pendant une minute puis incubée à 30°C
77 Une fois l’incubation terminée, on centrifuge à 2500 tr/mn pendant 10 mn, on lave les sédiments 2 fois avec 10 ml d’eau physiologique et à chaque fois on centrifuge à 2500 tr/mn pendant10 mn.
Par la suite, on fait une resuspension du sédiment dans 5ml d’eau physiologique stérile. Le nombre de bactéries contenus après culture et mutation est grand, il est donc préférable de procéder à des dilutions jusqu’à 10-5 comme schématiser dans la figure ci-dessous.
Figure n°16: Schéma de la dilution
II.1.3. Stabilisation des mutants
Le milieu complexe liquide a été solidifié à raison de 3% d’agar. Ce dernier est coulé dans des boites de Pétri qui seront ensemencées par les dilutions puis incubées à 28°C pendant 72 heures pour la stabilisation des mutants.
Il faut trois (03) boites à ensemencer pour chaque dilution. Sédiment de la souche +
5ml d’eau physiologique
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II.2. Criblage et sélection des mutants
Après apparition des colonies (supposées être des mutants), on procède à la méthode de réplicat selon LEDERBER et LEDERBERG (1952) pour sélectionner les mutants.
Le déroulement des étapes se fait comme suit :
Les trois (03) boites ensemencées par les dilutions de la souche vont servir à ensemencer une boite contenant le milieu solide, c’est la méthode des matrices.
Figure n°17: Schéma explicatif de la méthode des matrices
Après incubation commence alors la méthode de réplicat proprement dite. Celle-ci consiste à presser délicatement un disque de velours stérile sur la surface d’un milieu complexe (boite mère) portant les colonies des prototrophes et des auxotrophes. Des cellules de chacune des colonies adhèrent au velours qui est alors pressé légèrement sur la surface d’une boite stérile du milieu minimum (Guiraud, 1993 ; Singleton, 1999).
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Boites contenant les mutants
Boite contenant le milieu complexe
79 La composition des milieux complexe (Sano et Shiio, 1967) et minimum (Plachy, 1970 ; Kinoshita, 1985) est représentée dans le tableau n°12.
Tableau n°12: Composition en g/l des milieux solides complexe et minimum utilisés pour
l’isolement des colonies
Milieu minimum Milieu complexe
Glucose 1,0 100,0 (NH4)2SO4 1,0 40,0 Extrait de levure 1,0 K2HPO4 7,0 3,0 KH2PO4 2,0 1,0 MgSO4,7H2O 0,1 0,4 FeSO4 5,0 5,0 MnSO4 5,0 5,0 CaCO3 50,0 Citrate de sodium 0,4 Thiamine 2.10-4 Biotine 3.10-4 Agar 25 20 pH 7,5 7,5
Le milieu minimum est réparti en trente (30) flacons dont vingt-neuf (29) sont additionnés des acides aminés à raison de 100 µg/ml d’eau distillée (soit 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés).
1 seul acide aminé
Valine, Histidine, Alanine, Méthionine, Isoleucine, Thréonine, Glutamine, Arginine et on a fait les combinaisons suivantes :
2 acides aminés Isoleucine + Valine ; Isoleucine + Thréonine ; Isoleucine + Méthionine ;
80 Isoleucine + Alanine ; Thréonine + Alanine ; Thréonine + Méthionine ; Thréonine + Valine ; Méthionine + Alanine ; Méthionine + Valine ; Valine + Alanine. 3 acides aminés
Thréonine + Méthionine + Alanine ; Thréonine + Méthionine + Valine ; Thréonine + Méthionine + Isoleucine ; Méthionine + Valine + Alanine ; Méthionine + Valine + Isoleucine ; Valine + Isoleucine + Alanine.
4 acides aminés
Thréonine + Méthionine + Valine + Isoleucine ; Thréonine + Méthionine + Alanine + Valine ; Méthionine + Valine + Isoleucine + Alanine.
5 acides aminés
Thréonine + Méthionine + Valine + Isoleucine + Alanine.
Le dernier flacon reste libre des acides aminés. On autoclave les milieux à 121°C pendant 1 heure.
A l’aide d’un cercle en fer plein (dont la base ayant le même diamètre que la boite de Pétri) remplis de sable et recouvert de velours stérilisé, on a fait des empreintes sur les boites contenant les différents milieux à partir de la boite pour laquelle on a effectué la méthode des matrices, puis on a incubé à 28°C pendant 24 heures.
81 La réplication sur boites est particulièrement utilisée pour l’isolement et la sélection des mutants auxotrophes (Davids et al., 1990 ; Guiraud, 1993 ; Birge, 1994 ; Nicklin et al., 2000).
Quand une colonie de la boite mère ne se trouve pas sur la boite répliquée, on suppose qu’elle dérive d’un auxotrophe (Birge, 1994 ; Singleton, 1999).
La comparaison des boites initiales avec celles des différents milieux permet de repérer sur les boites de départ, les colonies auxotrophes qui apparaissent soit sur le milieu complexe soit sur le milieu minimum additionné d’un, de deux, de trois, de quatre ou de cinq acides aminés.
MM : Milieu minimum
Figure n°18: Schéma de la méthode de réplicat (NICKIN et al., 2000)
Les colonies supposées être des mutants vont être ensemencées sur gélose inclinée (TSA) et incubée à 28°C pendant 24 heures pour les stabiliser.
Le schéma suivant explique la stabilisation des mutants sur gélose inclinée. MM
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. . .
. . . .
MM + 1………… MM + 5
Acide aminé Acides aminés
Milieu complexe Velours stérile fixé sur un support
82 ● : colonies supposées être des mutants auxotrophes exigeantes en 1, 2, ou plusieurs acides aminés.
Figure n°19: Schéma explicatif de la stabilisation des mutants