L’alignement des séquences des GCPs permet de mettre en évidence des variations importantes dans le domaine N-terminal des GCPs. C’est notamment le cas pour GCP5 et GCP6 qui possèdent des insertions d’une taille importante par rapport à la séquence de GCP4 (Figure 26 A). Afin de mieux comprendre le rôle de ces insertions, j’ai généré des mutants résistants aux siRNAs dans lesquels ces régions ont été délétées. La capacité de ces mutants à compenser la perte de GCP5 ou GCP6 a été évaluée comme précédemment.
GCP6 possède une extension amino-terminale de 366 résidus, ainsi qu’une large insertion située dans le domaine N-terminal (674-1501). Cette insertion possède la capacité d’interagir avec les kératines (Oriolo et al. 2007). Au sein de cette insertion, il existe des séquences répétées en tandem qui sont phosphorylées par Plk4 (1027-1270) (Bahtz et al. 2012).
J’ai donc généré des mutants délétés soit de toute l’insertion ( 674-1501) soit uniquement des séquences répétées ( 1027-1270) ou bien de l’extension amino-terminale (367-1819) (Figure 26 A).
Pour GCP5, j’ai généré des mutants délétées d’une insertion de 77 résidus située à la fin du domaine N-terminal (627-704) (Figure 26 A). J’ai également généré un mutant délété de l’extension N-terminale de GCP5 (271-1024) (Figure 26 A).
De la même manière que pour les chimères, j’ai ensuite établi des lignées stables de cellules HeLa exprimant de manière inductible les mutants et étudié la capacité des mutants à compenser la déplétion de GCP5 ou GCP6 en termes d’assemblage du TuRC et de recrutement de la tubuline .
Tout comme pour la chimère N64C, pour les mutants de GCP6, il y a une fuite d’expression sans induction d’expression, après induction les mutants sont fortement exprimés (Figure 26 B).
Figure 26 : Etude du rôle de régions spécifiques de GCP5 et GCP6 dans la fonction des protéines. (A) Alignement des GCPs. GCP5 et GCP6 possèdent des régions additionnelles par rapport à GCP4. (B gauche) Western blot contre la tubuline sur les différentes fractions de gradients de sucrose. (B milieu) quantification du pourcentage de la tubuline dans la fraction 7 par rapport à la condition contrôle. (B droite) Western blot des différents extraits solubles soumit à fractionnement sur gradient de sucrose. Le x marque une bande non spécifique. (C gauche) Quantification de la proportion de fuseaux mitotiques dont le recrutement de la tubuline le long des microtubules est diminué. (C droite) Quantification de la proportion de fuseaux mitotiques monopolaires.
69 Après RNAi contre GCP6, l’expression du mutant de GCP6 délété des 366 premiers résidus ne permet pas de restaurer la formation du TuRC ni le recrutement de la tubuline au fuseau ou les défauts du fuseau mitotique. L’extension N-terminale de GCP6 est donc essentielle pour la fonction de GCP6.
L’expression du mutant de GCP6 délété des séquences répétées permet de restaurer l’assemblage du TuRC et permet la formation d’un fuseau mitotique correct après déplétion de GCP6 par RNAi. Les séquences répétées de GCP6 ne sont donc pas nécessaires à la fonction de GCP6 dans l’assemblage du TuRC ni à son recrutement le long du fuseau. Ces résultats sont cohérents avec ceux de Bahtz et al. 2012 qui avaient montrés que la phosphorylation de ces sites par Plk4 n’était pas essentielle pour la fonction de GCP6 dans le TuRC.
La délétion de toute l’insertion de GCP6 ne permet pas au mutant de compenser les effets observés suite à la perte de GCP6. Cependant, compte tenu de la taille de l’insertion de GCP6 (827 résidus) il est possible que sa délétion affecte considérablement la structure de GCP6 (Figure 26 B et C).
Ces données indiquent que l’insertion centrale de GCP6 ainsi que son extension N-terminale sont essentielles pour la fonction de GCP6. En revanche, les séquences répétées phosphorylées par Plk4 ne semblent pas impliquées dans l’assemblage du TuRC ni dans son recrutement le long des microtubules du fuseau mitotique.
Le mutant de GCP5 627-704 est exprimé à un niveau proche de celui de GCP5 endogène. Le mutant de GCP5 délété de l’insertion est capable de complémenter les effets de la perte de GCP5 endogène sur l’assemblage du TuRC et sur le fuseau mitotique, suggérant que cette insertion n’est pas essentielle à la fonction de GCP5 (Figure 26 B et C).
Pour le mutant délété de son extension N-terminale, malgré plusieurs essais, je n’ai trouvé aucun anticorps capable de détecter la protéine mutante. Je n’ai donc pas pu vérifier que le mutant était bien exprimé dans la lignée. J’ai néanmoins testé ce mutant et les résultats indiquent qu’il n’est pas capable de compenser la perte de GCP5. Mais tant que je ne pourrai pas confirmer que le mutant test bien exprimé dans cette lignée, je ne pourrai pas tirer de conclusion quant au rôle de l’extension N-terminale de GCP5.
Il serait intéressant de savoir si les extensions N-terminales des autres GCPs (2, 3 et 5) sont tout aussi importantes. Pour GCP5, il faudrait soit obtenir un anticorps permettant de vérifier l’expression du mutant dans la lignée dont nous disposons déjà ou bien établir une nouvelle
lignée exprimant un mutant étiqueté à son extrémité C-terminale. Pour GCP2 et GCP3, il faudrait établir une nouvelle lignée exprimant les mutants. Pour simplifier l’analyse, l’utilisation d’une étiquette fusionnée à l’extrémité C-terminale des mutants serait souhaitable.
J’ai également cherché à savoir si l’extension N-terminale était suffisante pour déterminer l’identité d’une GCP. J’ai construit une chimère contenant l’extension N-terminale de GCP2, le domaine N-terminal de GCP4 et le domaine C-terminal de GCP2 (N242C) (Figure 27). J’ai étudié la capacité de cette chimère à restaurer la formation du TuRC après déplétion de GCP2. De la même manière que précédemment, après déplétion de GCP2, la quantité de TuRC et de TuRC est fortement diminuée. Après déplétion de GCP2, la chimère N242C est bien exprimée comme on peut le voir sur le gradient (. L’expression de la chimère N242C ne permet pas de restaurer la formation des TuSC ou des TuRC. La chimère N242C n’est donc pas capable de compenser la perte de GCP2.
La spécificité de GCP2 ne réside donc pas uniquement dans son extension N-terminale mais dans tout son domaine N-terminal.
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Figure 27 : La spécificité de GCP2 n’est pas portée uniquement par son extension N- terminale. Une chimère contenant l’extension N-terminale de GCP2 suivie du domaine N-terminal de GCP4 et du domaine C-terminal de GCP2 a été construite (haut). Western blot contre la tubuline sur les différentes fractions de gradients de sucrose (gauche). Quantification du pourcentage de la tubuline dans la fraction 7 par rapport à la condition contrôle (droite).
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