Sabe-se que o uso de elicitores em plantas, como o acibenzolar-S- metílico (ASM), pode melhorar a resistência contra o ataque de patógenos. Além disso, experimentos anteriores mostraram que a aplicação de ASM em plantas de laranja doce conseguiu retardar a detecção de Ca. L. asiaticus na copa de plantas de nove meses de idade, inoculadas via enxertia (AGNELLI, 2011). No entanto, não são compreendidos quais são os mecanismos de resistência ou sinalização que estão envolvidos nesse processo.
O ácido jasmônico (AJ), bem como o ácido salicílico (AS), são compostos fenólicos constitutivos nas plantas. Sua biossíntese e importância na sinalização de respostas de defesa já são bem caracterizadas. A biossíntese de AS pode culminar na expressão de genes que promovem a resistência sistêmica adquirida (RSA) (MAUCH-MANI & MÉTRAUX, 1998). Em um estudo de quantificação dos fitormônios em tecidos foliares, a laranja doce apresentou maior conteúdo de AJ (54 ng/g tecido fresco) e de OPDA (85 ng/g tecido fresco) do que de AS (29 ng/g tecido fresco) (TRAPP et al., 2014).
A aplicação exógena de ASM (Acibenzolar-S metílico) pode induzir resistência sistêmica adquirida (RSA), e o acúmulo de proteínas relacionadas à patogênese (PR-Proteínas) em plantas de tabaco contra doenças bacterianas e fúngicas (Pseudomonas syringae pv. tabaci;
Thanatephorus cucumeri; Cercospora nicotianae) (COLE, 1999), contra
doenças bacterianas em citros (Xanthomonas citri subsp. citri) (FRANCIS et al., 2009; GRAHAM & MYERS, 2011) e em diversas outras culturas. No Brasil, ASM possui registro comercial para o tratamento de doenças bacterianas em diversas culturas como, algodão e tomate (AGROFIT, 2016).
3.4.2.1 Via de biossíntese do ácido jasmônico
A biossíntese de jasmonatos é iniciada a partir do ácido α- linolênico, que é um composto abundante no cloroplasto das células vegetais. A lipoxigenase (13-LOX ou LOX) está diretamente envolvida e atua na conversão de ácido α- linolênico em 13 (S) -hidroperóxi- octadecatrienóico no plastídio das células (MULLER, 1997; STENZEL
et al., 2012). As lipoxigenases são fundamentais na etapa inicial de biossíntese de AJ, e seu envolvimento em respostas de defesa é relatado em plantas de batata contra o ataque de agentes patogênicos (KOLOMIETS et al., 2000). Em A. thaliana são conhecidos quatro 13- LOX (LOX2, LOX3, LOX4 e LOX6) (CALDELARI et al., 2011).
Em plantas inoculadas com Ca. L asiaticus, a expressão de LOX foi alterada em função da presença da bactéria, especialmente no experimento I. No experimento II os níveis de expressão de LOX se mantiveram muito próximos aos do controle na maioria das avaliações. De acordo com estes resultados, há indícios de que no experimento II a evolução da infecção por Ca. L. asiaticus, inclusive, tenha reduzido a expressão de LOX, uma vez que para a maior parte das avaliações, tratamentos compostos somente pela inoculação da bactéria foram inferiores aos compostos pela bactéria mais o ASM.
Alguns trabalhos mostram que a inoculação com a bactéria altera a expressão de LOX, contudo, em momentos diferentes após a infecção. COERINI (2014) estudou plantas de citros inoculadas com Ca. L asiaticus e observou aumento significativo na expressão de LOX2 aos 30 dias após a enxertia das plantas. ALBRECHT & BOWMAN (2008) avaliaram plantas de laranja doce 17 semanas após a inoculação das plantas pela técnica do microarray, e observaram alterações no perfil de diversos transcritos e entre eles, de transcritos de LOX2, que neste período estavam sendo induzidos na presença da bactéria.
Em plantas pulverizadas com ASM no experimento I, os níveis de expressão se mantiveram muito próximos aos observados no controle. Já no experimento II, aparente o tratamento com ASM induziu a expressão de LOX. Pelas discrepâncias observadas na expressão LOX entre os resultados dos experimentos I e II, haveria necessidade de experimentos adicionais, assim seria possível inferir se em plantas de laranja doce, é a inoculação da bactéria ou a pulverização das plantas com ASM que causa alterações na expressão desse gene.
O segundo passo na biossíntese do ácido jasmônico é mediado pela enzima aleno óxido sintase (AOS) que metaboliza 13 (S) -hidroperóxi- octadecatrienóico nos plastídios das células, convertendo-o para o ácido 12,13-epoxi-linolénico (óxido de aleno) (MULLER, 1997). Para o patossistema Citrus x HLB, das dez avaliações realizadas, somente em uma delas os níveis de expressão de AOS em plantas tratadas com ASM foram superiores aos obtidos para o controle no mesmo período de tempo avaliado. A expressão de AOS em plantas tratadas com ASM, de uma maneira geral, foi inferior ao observado no controle, para os experimentos I e II. Esses resultados sugerem que, possivelmente a regulação negativa
na expressão desse gene esteja relacionada especificamente à infecção por
Ca. L. asiaticus e aos mecanismos de patogenicidade da bactéria em
suprimir as respostas de defesa desencadeadas pelas plantas durante a colonização inicial. Esta redução na expressão de AOS causada por Ca. L. asiaticus em plantas de citros pode estar prejudicando a biossíntese deste fitormônio e as sinalizações de respostas de defesa das plantas que são mediadas por essa via.
PARK et al. (2002), avaliando a importância de AOS na biossíntese de AJ, compararam plantas de A. thaliana selvagens com mutantes que não expressavam constitutivamente esse gene. Após a realização de ferimentos mecânicos nas folhas em ambas as plantas, os níveis de AJ aumentaram entre 50 e 100% nas plantas selvagens em relação às mutantes. Além disso, a cinética de indução após o ferimento das folhas foi alterada significativamente nas plantas mutantes. Outro estudo mostrou que plantas de batata superexpressando o gene AOS, também possuíam AJ em níveis 12 vezes maiores em relação a plantas não transformadas (HARMS et al., 1995).
A aplicação de ASM aparentemente não altera a expressão de AOC, pois para a maioria dos tempos avaliados os níveis de expressão deste gene em plantas pulverizadas com este produto permaneceu igual ou levemente superior ao observado no tratamento controle. Aleno óxido ciclase (AOC) é a enzima responsável pela conversão de aleno óxido sintase para cis- (+) -OPDA. Essa enzima é considerada crucial na biossíntese de AJ, pois seu produto atua como substrato do (+) -7-iso-JA, precursor da forma ativa de AJ nas plantas. Em A. thaliana são conhecidos quatro transcritos funcionais para esse gene (AOC1 a AOC4), que ocorrem nos plastídios da célula e estão envolvidos em processos do crescimento e desenvolvimento de botões florais e senescência de
Arabdopsis (STENZEL et al., 2012).
A expressão de AOC em plantas de laranja doce inoculadas com a
Ca. L. asiaticus foi significativamente maior no experimento I, ao longo
de todas as avaliações. Esses resultados indicam que as plantas ativaram a via do ácido jasmônico em resposta à colonização da bactéria no experimento I.
A resposta de defesa de plantas cítricas pode ser variável no que diz respeito à expressão desse gene e a colonização por Ca. L asiaticus. Além disso, outros genes homólogos também podem estar envolvidos na expressão de AOC. Em um estudo realizado por COERINI (2014), foi avaliada a expressão do homólogo AOC3 em plantas de citros inoculadas com Ca. L asiaticus aos 7 e 30 dias após a inoculação e em plantas sintomáticas, mas nesse caso não foram observadas alterações
significativas na expressão desse gene. Do mesmo modo que observado nos experimentos I e II em relação à expressão LOX, há necessidade de maiores investigações em relação à expressão de AOC, assim seria possível inferir qual é o principal fator que causa alterações na expressão desse gene em plantas de laranja doce.
A ácido carboxil metil transferase, (JMT), é uma enzima que atua na produção do metil jasmonato (Me-JA), um derivado do ácido jasmônico. Esse composto volátil possui função sinalizadora intra e intercelular nas plantas, mediando o processo de desenvolvimento e de respostas de defesa nas plantas ao ataque de patógenos e herbívoros e na sinalização do ataque de patógenos e ativação de mecanismos de defesa (FARMER & RYAN, 1990; FARMER & RYAN, 1992; SEO et al., 2001; CHEONG & CHOI, 2003).
Em plantas tratadas com ASM houve indução significativa da expressão de transcritos do gene JMT, sendo que isso ocorreu em todos os períodos de tempo avaliados nos experimentos I e II. SEO et al. (2001) observaram que plantas trangênicas de A. thaliana que superexpressavam JMT apresentaram elevada resistência a B. cinerea em relação às plantas do tipo selvagem indicando ser uma enzima chave na regulação das respostas de defesa mediadas por jasmonatos.
Experimentalmente, é comprovado que aplicações exógenas de ácido jasmônico ou ácido salicílico em plantas podem induzir rapidamente a expressão de transcritos da via biossintética do ácido jasmônico. RODRÍGUEZ et al. (2014) mostraram que a aplicação exógena de AJ induziu a expressão de AOS e conferiu resistência em frutos de Citrus clementina a Penicillium expansum. A expressão de JMT também é alterada mediante a aplicação exógena de metil jasmonato ou por injúrias mecânicas causadas por insetos e patógenos de acordo com FARMER & RYAN, (1990). Para o patossistema Citrus x HLB, AGNELLI (2011) observou efeito na infecção de Ca. L. asiaticus após a aplicação exógena de ácido jasmônico [1 mM] ou metil jasmonato [2 mM]. Entretanto, observou-se que poucos são os estudos que envolvem as implicações de aplicações exógenas de ASM em plantas de citros e sobre os efeitos causados na expressão de genes na via do AJ. Verificou- se que em plantas inoculadas via enxertia com Ca. L. asiaticus, houve alterações pontuais na expressão de JMT. Esses resultados poderiam ser diferentes se tivessem sido realizados com plantas já sintomáticas para HLB, como observado por COERINI (2014), onde somente em plantas de citros que já exibiam sintomas de HLB houve incremento na expressão desse gene.
De maneira geral, dos genes envolvidos na biossíntese de ácido jasmônico e que foram estudados em plantas cítricas enxertadas com borbulhas infectivas, os genes LOX e AOC foram induzidos em plantas positivas para HLB somente no experimento I. Já o gene AOS foi reprimido. De maneira similar, o estudo envolvendo a expressão de genes de laranja pela técnica do microarray para o patossistema Citrus x Liberibacter, em plantas de laranja ‘Valência' por 19 semanas após inoculação com Ca. L. asiaticus mostrou que a infecção da bactéria pode reprimir os transcritos que codificam a tradução de sinais que são tipicamente induzidos na via dos jasmonatos (ALBRECHT & BOWMAN, 2008).
A elevada expressão de JMT em plantas tratadas com ASM indica que sua aplicação exógena poderia atuar diretamente no processo de comunicação entre plantas por aleloquímicos voláteis. Assim, pode ser que o pool endógeno de ácido jasmônico esteja sendo preferencialmente convertido em metil jasmonato mediante a aplicação do indutor ASM. 3.4.2.2 Vias de biossíntese do ácido salicílico
O ácido salicílico (AS) é um composto fenólico comum em muitas plantas, presente constitutivamente. Um importante papel fisiológico atribuído ao ácido salicílico é o de atuar como uma molécula sinalizadora. Tal fato é evidenciado pelo acúmulo de AS em plantas submetidas a condições adversas, como ataque de fitopatógenos ou pela indução por elicitores abióticos (MARTINEZ et al., 2000).
Em 1979, observou-se pela primeira vez que a aplicação exógena de AS (Aspirina®) em plantas de tabaco, reduziu o número de lesões
causadas por Tobacco mosaic virus (TMV) em mais de 90%. Além disso, houve acúmulo de PR-proteínas e estabelecimento da RSA (WHITE, 1979). Outros estudos também relataram esse fato (GAFFNEY et al., 1993; DEMPSEY et al., 2011).
A biossíntese do ácido salicílico pode ocorrer por duas vias derivadas do corismato (produto final da via do chiquimato): a via do ácido isochorísmico (ICS) no cloroplasto da célula e a via da fenilalanina amônia-liase (PAL), no citoplasma (DEMPSEY et al., 2011; STENZEL et al., 2012; TOUNEKTI et al., 2013).
3.4.2.2.1 Via do isocorismato sintase (ICS) na biossíntese do ácido salicílico
Foram observados maiores níveis de expressão de ICS1 e ICS2 anteriormente à detecção de Ca. L asiaticus na copa, no experimento I. Já no experimento II, a inoculação com a bactéria parece não ter ativado com a mesma intensidade essa via de biossíntese. Como a bactéria possui um longo e variável período de latência, acredita-se que os que níveis de expressão desses genes sejam variáveis até o período onde há título suficiente de bactéria para expressão dos sintomas. Entretanto, OLIVEIRA (2013) avaliou a expressão de ICS1 em plantas de citros inoculadas com Ca. L. asiaticus e não observou alterações significativas aos 0 e 30 D.A.E. e nas plantas exibindo sintomas de HLB.
Em A. thaliana, genes homólogos de ICS (ICS1 e ICS2) foram avaliados após aplicação exógena de AS nas plantas. Nesse caso, o gene ICS1 foi fundamental para a indução da RSA e para a síntese de compostos de defesa das plantas, sendo responsável por 90% da biossíntese do ácido salicílico associado a RSA (WILDERMUTH et al., 2001).
Buscando esclarecer se a biossíntese de AS em N. benthamiana é derivada e dependente de ICS, como descrito para A. thaliana (WILDERMUTH et al., 2001), CATINOT et al. (2008) silenciaram o gene ICS em plantas de N. benthamiana e inocularam com Pseudomonas
syringae, observando que não houve acúmulo de AS nas plantas onde o
gene ICS havia sido silenciado.
Não há estudos sobre a relação de aplicação de ASM e expressão de ICS, tornando o nosso estudo pioneiro. Contudo não foram observadas alterações na expressão de ICS1 e ICS2 O mesmo não foi observado para os experimentos I e II.
3.4.2.2.2 Via da fenilalanina amônia liase (PAL) e modificações do ácido salicílico
Na maioria das plantas, a biossíntese do ácido salicílico é dependente da biossíntese de fenilalanina. A expressão de PAL pode ser induzida em plantas submetidas a estresses bióticos e abióticos. Além disso, esta enzima possui papel fundamental no desenvolvimento das plantas (OHL et al., 1990; CHEN et al., 2009; LAFUENTE et al., 2003). Mesmo que aparentemente contribua com menos de 10% do total na biossíntese de ácido salicílico, estudos sugerem que expressão de PAL é importante para a mediação das respostas de defesa desencadeadas por patógenos e na ativação da RSA (CHEN et al., 2009).
PALLAS et al. (1996) estudaram plantas de N. tabacum infectadas com TMV e que não expressavam fenilalanina amônia-liase 2 (PAL2) e
constataram que além de atuar na biossíntese de AS, essas enzimas são extremamente importantes na percepção e sinalização da RSA. Além disso, ELKIND et al. (1990) observaram que plantas transgênicas de tabaco com supressão da expressão de PAL apresentavam uma série de modificações fenotípicas, como alterações em forma e textura das folhas, menor lignificação do xilema e desenvolvimento, indicando que a perturbação da PAL reflete diretamente na morfologia, pigmentação e nos sinais dependentes da biossíntese de fenilpropanóides.
Verificou-se que os perfis de expressão foram distintos entre os experimentos I e II para todos os genes PAL (PAL1, PAL2, PAL3, PAL4 e PAL5). No experimento II, plantas inoculadas com Ca. L. asiaticus tiveram maiores níveis de expressão de PAL2 e PAL5 em relação ao controle para a maioria das avaliações realizadas. Já no experimento I, com poucas exceções, os níveis de expressão dos genes PAL, seguiram perfis de expressão próximos aos observados nas plantas controle. Isso sugere que as plantas do experimento II mostraram maior reação à colonização por Ca. L. asiaticus. Diferentemente do observado no presente estudo, OLIVEIRA (2013) observou maiores níveis de expressão desses genes em plantas de laranja doce (C. sinensis) inoculadas com Ca. L. asiaticus no período correspondente aos 0 e 30 D.A.E. Além disso, em plantas sintomáticas, os níveis de expressão desses genes foram reduzidos. Essa redução foi atribuída ao lento processo de colonização da bactéria somada à resposta inicial de defesa das plantas. ALBRECHT & BOWMAN (2012) observaram pela técnica do microarray em 'Cleópatra' mandarim (C. reticulata) que vários transcritos de genes relacionados à patogênese foram expressos em plantas suscetíveis ao HLB, como a PAL.
Dessa forma, acredita-se que as plantas não permaneceram passivas à invasão da bactéria. A diferença entre a resistência ou susceptibilidade, pode estar associada à velocidade e magnitude com que a defesa basal das plantas é expressa. Em alguns casos de interação planta- patógeno ocorre o reconhecimento da invasão do patógeno pelo hospedeiro, mas a resposta de defesa das plantas não ocorre com a rapidez necessária para conter a infecção (MALAMY & KLESSIG, 1992; YANG et al., 1997; JONES & DANGL, 2006). Outros trabalhos também demonstraram que os patógenos podem ser virulentos por conseguirem “burlar” os mecanismos de defesa das plantas. CUI et al. (2005) observaram que uma estirpe virulenta de Pseudomonas syringae pode induzir a susceptibilidade em plantas de A. thaliana, pois essa bactéria tem a capacidade de produzir coronatina (COR) e imitar a função estrutural do AJ, regulando o cross talk entre as vias do AS e AJ nessas
plantas e a susceptibilidade a insetos (herbívoria). Além disso, vários fatores podem influenciar na expressão de PAL, dentre eles ferimentos, invasão e colonização por patógenos, condições de luminosidade às quais as plantas estão submetidas e aplicação exógena de produtos como o AS (WEN et al., 2005).
De uma maneira geral, a aplicação de ASM não incrementou a expressão de PAL nos experimentos I e II com a mesma significância observada nos tratamentos onde houve inoculação da bactéria. Diferentemente do observado para PAL em citros, aplicações exógenas de ácido salicílico induziram resistência contra Fusarium oxysporum e aumento nos níveis de expressão de fenilalanina amônia-liase em tomateiro (JENDOUBI et al., 2015). Além disso, esses baixos níveis de expressão de PAL observados em plantas pulverizadas com ASM também pode ter relação com o período no qual as amostras eram coletadas para as análises.
A expressão da glicosil-transferase do ácido salicílico (SAGT1) foi alterada pela presença de Ca. L. asiaticus e, em menor escala pela indução com ASM, ficando isso mais evidente no experimento I. Acredita-se que a expressão de SAGT1 pode estar diretamente envolvida com a ativação e regulação dos mecanismos de defesa das plantas. Sugere-se isso pelo fato de que OLIVEIRA (2013) também avaliou a expressão de SAGT1 no patossistema Citrus x Liberibacter. O autor observou que as alterações mais significativas na expressão desse gene ocorrem principalmente em plantas cítricas que já apresentam visualmente sintomas de HLB. Resultados similares são relatados por MANN et al. (2012). Entretanto, no presente trabalho, não foram avaliadas plantas em estágios mais avançados de infecção e que já exibiam sintomas visuais.
Ácido salicílico carboxil metil transferase (BSMT1) é uma enzima que modifica o AS. É responsável pela formação do metil salicilato (Me- SA) e atua na sinalização das plantas na RSA a patógenos invasores e na comunicação entre as plantas pela emissão de sinais voláteis (PARK et al., 2007; MANN et al., 2012), Normalmente, em plantas saudáveis, esse gene é observado a nível constitutivo e em baixas concentrações, entretanto, fatores abióticos como a temperatura, por exemplo, podem afetar diretamente a síntese e emissão desse volátil.
SHULAEV et al. (1997) mostraram que o Me-SA não é detectado em plantas de tabaco inoculadas com TMV e submetidas a temperaturas de 32° C. Enquanto isso, em plantas que estavam expostas a temperaturas médias de 24º C, a produção de Me-SA alcançou 283 ng/hora nas plantas, e permaneceu em níveis elevados até 60 horas após a inoculação.
Diferentes condições de luminosidade também podem influenciar na expressão e acúmulo de Me-SA (LIU et al., 2010).
Alguns trabalhos disponíveis sobre BSMT1 demonstram que podem ocorrer variações nas reações das plantas em relação à expressão desse gene e nas respostas de defesa. Por exemplo, SONG et al. (2009) observaram em plantas de A. thaliana que mutantes que não expressavam BSMT1 tinham nível reduzido de emissão de Me-SA e que isso estava diretamente relacionado ao acúmulo de AS nos tecidos, além disso observaram que após a inoculação das plantas com P. syringae, houve incremento significativo na expressão do gene BSMT1. Ao contrário, KOO et al. (2007) avaliaram plantas transgênicas de A. thaliana que superexpressavam BSMT1, e constataram que essas plantas possuíam Me-SA constitutivamente e em quantidades suficientes para o envio do sinal volátil, entretanto essas plantas eram mais susceptíveis à P. syringae em relação às plantas do tipo selvagem. Uma das justificativas seria o fato de que a conversão de AS para o seu volátil Me-SA e consequentes perdas por emissão reduzem os níveis de AS na planta. Estas mesmas plantas quando pulverizaram com AS obtiveram níveis ainda elevados de emissão desse volátil.
Nas plantas onde houve aplicação de ASM, o gene BSMT1 foi altamente induzido, entretanto, os níveis de expressão variaram no decorrer do tempo para os experimentos I e II. Acredita-se que outros fatores, além da aplicação de ASM, possam estar associados a essas variações. Além disso, um aspecto que merece maiores investigações é o fato de que alguns trabalhos sugerem que a maior preferência de D. citri por plantas de citros com HLB em relação às sadias tem relação com