Molécules synthétiques ciblant CXCR7

L’équipe de recherche du Dr. Schall a développé des petites molécules synthétiques inhibitrices ciblant spécifiquement le récepteur de chimiokine CXCR7 (Burns et al., 2006; Zabel et al., 2009). Ces molécules synthétiques dont l’information structurale est gardée secrète sont fabriquées par la compagnie Chemocentryx. CCX771 et ses analogues tels que CCX754 et CCX733 ont été vite considérés comme des antagonistes du récepteur CXCR7 étant donné qu’ils inhibent la liaison de CXCL12 à CXCR7. Ces molécules présentent une forte affinité de liaison à CXCR7 aux alentours de 5nM. Cependant, en 2009, deux équipes de recherche observent que le CCX771 est plutôt un agoniste sur CXCR7 puisqu’il induit le recrutement de la β-arrestine à ce dernier (Luker et al., 2009a) (Zabel et al., 2009). De plus, ces molécules ont été montrées pour leur efficacité à réduire la taille des tumeurs de multiples cancers comme par exemple le lymphome humain de type B (Burns et al., 2006; Zabel et al., 2009). Le récepteur de chimiokine CXCR4 ainsi que son ligand naturel, CXCL12 ont été montrés pour être exprimés au sein des cellules de Schwann et des astrocytes dans le système nerveux central. Le Dr. Schall et son équipe de recherche s’intéressent notamment à l’axe CXCL12/CXCR7 puisqu’il est impliqué dans plusieurs pathologies du cerveau tel que le glioblastome multiforme. Avant la découverte du récepteur de chimiokine CXCR7, CXCR4, à lui seul, avait été observé comme régulateur de la prolifération et du degré

d’invasion des tumeurs d’astrocytomes. Toutefois, Odemis et al. montrent, en 2010, que c’est plutôt CXCR7 et non CXCR4 qui est, à lui seul, responsable de la signalisation de CXCL12 au niveau des astrocytes et que la stimulation avec CCX754 a pour effet d’inhiber les effets de CXC12 sur CXCR7 (Ödemis et al., 2010).

À la lumière de ces recherches, la molécule CCX662 a été développée sous prétexte qu’elle était un prototype plus réaliste contre le traitement du cancer du cerveau chez l’humain. D’ailleurs, cette molécule est présentement en évaluation pré-clinique pour le traitement du glioblastome multiforme (Bachelerie et al., 2014). Notamment, Walter et al. montrent que la molécule CCX662 nouvellement développée pour cibler CXCR7 a pour effet de diminuer la taille des tumeurs et d’empêcher le caractère récurrent de la tumeur associée au glioblastome multiforme suite à la radiothérapie, et ce, en interférant avec les cellules souches dites cancéreuses (Walters et al., 2014).

OBJECTIFS DE LA THÈSE a.! Problématique

Avant la découverte du récepteur de chimiokine CXCR7, la chimiokine CXCL12 était considérée comme liant exclusivement le récepteur de chimiokine CXCR4. Or, le récepteur CXCR7 a été montré pour lier, lui aussi, la chimiokine CXCL12 (Balabanian et al., 2005). Cette découverte incite la communauté scientifique à revisiter les rôles de l’interaction entre CXCR4 et CXCL12. À cet effet, plusieurs groupes de recherche ont émis l’hypothèse que CXCR7 serait un récepteur dépourvu de signalisation parce qu’il n’activait pas la protéine G hétérotrimérique. Contrairement à cette hypothèse, notre groupe a été le premier à observer que CXCR7 induit plutôt le recrutement de la β- arrestine au récepteur suite à sa stimulation par CXCL12 (Kalatskaya et al., 2009). De plus, nous avons identifié qu’un antagoniste synthétique de CXCR4, l’AMD3100, agit comme un agoniste sur CXCR7 en induisant le recrutement de la β-arrestine, démontrant que ce ligand n’est pas sélectif ni exclusif à CXCR4. À la lumière de ces résultats, il devenait primordial de réévaluer la sélectivité de molécules réputées pour cibler exclusivement le récepteur CXCR4, notamment de la molécule thérapeutique TC14012.

Ensuite, en plus de la chimiokine CXCL12, CXCR7 possède un autre ligand naturel, la chimiokine CXCL11 (Burns et al., 2006). La présence de ces deux ligands endogènes liant le même récepteur met de l’avant un concept important, celui de la sélectivité fonctionnelle. Il a été découvert que même s’il existe une ressemblance structurelle entre les chimiokines, elles peuvent avoir des rôles différents sur la signalisation intracellulaire (Zidar et al., 2009).

b.! Hypothèses et objectifs de recherche de la thèse

Le but de cette thèse consiste à identifier et à mieux caractériser les mécanismes d’action de CXCR7, ce qui est essentiel pour le développement éventuel de molécules thérapeutiques sélectives à CXCR7. Pour atteindre ce but, deux hypothèses principales ont été adressées et sont l’objet des deux publications annexées à cette thèse (Gravel et al., 2010)(Gravel et al. en préparation).

1-! Puisque nous avions démontré que l’AMD3100 était ni sélectif ni exclusif à CXCR4, en agissant comme agoniste sur CXCR7 en induisant le recrutement de la β-arrestine, nous avons émis notre première hypothèse de recherche:

Que la molécule thérapeutique TC14012, une molécule thérapeutique réputé pour cibler exclusivement le récepteur CXCR4 pourrait aussi cibler CXCR7 selon le concept de promiscuité des chimiokines.

Pour y répondre, nous avions les principaux objectifs suivants : 1-! Déterminer si TC14012 interagit avec le récepteur CXCR7.

2-! Déterminer si TC14012 agit comme agoniste sur ce dernier en induisant le recrutement de la β-arrestine.

3-! Identifier les déterminants moléculaires du recrutement différentiel de la β- arrestine à CXCR7 et à CXCR4.

Pour répondre à cette hypothèse et à ces objectifs de recherche, nous avons effectué des essais de radio-liaison et des expériences de BRET pour évaluer le rôle de TC14012 sur le recrutement de la β-arrestine aux récepteurs. De plus, puisque la β- arrestine est typiquement recrutée à la partie C-terminale des 7TMRs, ces expériences auront nécessité la création de récepteurs mutants où les parties C- terminales des récepteurs ont été interchangées. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication dans une revue scientifique en 2010 (Gravel et al., 2010).

2-! Puisqu’il a été démontré que plus d’une chimiokine pouvaient lier un même récepteur, et que celles-ci pouvaient induire des réponses de signalisation intracellulaire différentes (Berchiche et al., 2011; Burns et al., 2006; Zidar et al., 2009), nous avons émis notre deuxième hypothèse de recherche :

Que CXCL11 et CXCL12, des chimiokines endogènes de CXCR7, induisent une signalisation intracellulaire différentielles de la β-arrestine sur CXCR7.

Pour y répondre, nous avions les objectifs suivants :

1-! Déterminer les différences de recrutement de la β-arrestine à CXCR7 en réponse à CXCL11 et CXCL12.

2-! Déterminer l’impact du recrutement différentiel de la β-arrestine sur le transport intracellulaire de CXCR7.

3-! Déterminer l’impact du recrutement différentiel de la β-arrestine sur la dégradation des chimiokines induites par CXCR7.

Pour répondre à cette hypothèse et à ces objectifs de recherche, nous avons généré des mutants ponctuels dans des résidus clés des motifs E/DRYLAIV et N(L/F)YSS, qui sont décrits dans la littérature pour être essentiel dans l’activation des récepteurs (Lagane et al., 2005; Rovati et al., 2007; Zhang et al., 2002). Nous avons évalué le recrutement de la β-arrestine par la technique de BRET. Nous avons étudié le transport intracellulaire du récepteur (c’est-à-dire la variation d’expression du récepteur à la surface cellulaire, son internalisation et son recyclage) par des expériences de cytométrie en flux. La dégradation des chimiokines a été évalué par des expériences de radioactivité. Ces travaux feront éventuellement l’objet d’une publication dans une revue scientifique (Gravel et al. en préparation).