En pathologie végétale, une épidémie désigne une maladie infectieuse déclenchée par un agent pathogène, qui se manifeste sous forme de poussées soudaines et inhabituelles et se propage rapidement dans une région ou population végétale donnée pendant une période donnée (Rapilly, 1991). Elle touche alors une part importante de la production et l’incidence de la maladie augmente de manière significative par rapport à la situation sanitaire habituelle, entraînant des conséquences phytosanitaires dramatiques. Il peut arriver qu’une épidémie disparaisse pendant très longtemps. Dans le cas où la maladie est présente en permanence et dont l’incidence s’exprime de façon constante dans une population donnée ou une région précise (foyers infectieux), on a une endémie. Cet état est souvent associé à une coévolution de l’agent pathogène et son hôte sur de longues périodes de temps. Un déséquilibre du système épidémiologique peut induire une endémie à un état d’épidémie. Enfin, une épidémie est qualifiée de pandémie lorsqu’elle touche une très large population sur un vaste territoire géographique, généralement à l’échelle mondiale (Ravelomanantsoa, 2016).
En épidémiologie, on recherche à comprendre l’histoire de la maladie, notamment en apportant un éclairage sur la nature de l’agent pathogène responsable de l’épidémie, les sources et réservoirs possibles d’inoculum, les modes et mécanismes de dispersion de l’agent pathogène, et la prévalence des types particuliers d’une espèce d’agent pathogène donné (Ravelomanantsoa, 2016). C’est pour cela que la connaissance de la structure des populations de l’agent pathogène conditionne toute stratégie d’intervention pour le contrôle d’une épidémie. Les facteurs environnementaux jouent un rôle important, impactant sur la gravité et la propagation de toute maladie. L’hôte favorable, le pathogène et les conditions météorologiques conduisent à l'établissement de la maladie (Agrios, 2005).
Ainsi, avant de proposer la stratégie de gestion de la maladie, une connaissance approfondie en ce qui concerne l'épidémiologie des maladies doit être étudiée (Saxena et al., 2017). De nos jours de nombreux progrès ont été accomplis pour déduire l'historique des populations phytopathogènes à partir des connaissances, outils divers dont les approches moléculaires.
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1.1-De l’espèce à la population bactérienne :
L'espèce biologique est définie comme un ensemble d'organismes se reproduisant entre eux, mais pas avec ceux d'une autre espèce (Denamur & Picard, 1995). Le concept d’espèce bactérienne comme le concept général d’espèce ont d’abord été définis comme des regroupements phénotypiques (Sokal & Crovello, 1970). Dans cette approche, des traits tels que la dégradation ou le métabolisme de certains composés, la capacité à produire ou à résister à des antibiotiques, la capacité à croitre sur certains composés azotés ou carbonés, la coloration de Gram ou le phénotype cellulaire permettaient de différencier les différents groupes (Goodfellow et al.,1997) .
L’espèce était alors déterminée par une approche phénétique basée sur des caractères morphologiques. Les organismes présentant le plus grand nombre de caractères en commun étaient regroupés au sein de la même espèce, sans ascendances communes définies. Avec l’avènement des techniques moléculaires, l’amélioration de nos connaissances et l’émergence du concept d’horloge moléculaire, la systématique bactérienne a adopté depuis les trois dernières décennies des approches basées sur l’observation de variations de séquences nucléotidiques ou protéiques (Toussaint, 2018).
Presque toutes les bactéries (Figure 1) sont des microorganismes unicellulaires, procaryotiques donc ne disposant pas de noyau véritable ou d’autres organites comme la mitochondrie. Toutes possèdent une enveloppe cellulaire (membrane) tandis que la plupart ont une paroi qui détermine dans la plupart des cas la forme de la bactérie : ronde (Cocci ou coque), forme spiralée ou forme allongée (bacilliforme ou Bacillus)(Schumann & D’Arcy, 2010).
Quant au mode de reproduction des bactéries, ce sont des êtres vivants haploïdes à reproduction clonale, c’est-à-dire qu’une bactérie mère donne naissance à deux bactéries filles identiques entres elles et où les filles sont identiques ou génétiquement très proches de la mère si elles ont subi une ou plusieurs mutations pendant la réplication. Les bactéries sont considérées comme des organismes asexués en raison de leur division par fission binaire (Smith et al., 1993; Trevors, 1998).
Mais chez les bactéries, la reproduction et l'échange de gènes chromosomiques sont des fonctions indépendantes, à l'inverse de la majorité des animaux et des plantes où ces deux fonctions sont liées (Dykhuizen & Green, 1991). Ainsi, la reproduction est asexuée chez l'ensemble des bactéries et les recombinaisons entre souches sont dues à des transferts
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horizontaux. En conséquence, l'espèce bactérienne a-t-elle une réalité et, dans ce contexte, comment la définir ?
Figure 1 : Schéma d’une cellule bactérienne
(Adapté de Schumann & D’Arcy, 2010)
Une définition simple indique qu’une espèce bactérienne est une catégorie taxonomique de base des bactéries ; un groupe nommé au-dessous du niveau du genre dont les membres présentent un degré élevé de similitude globale comparé à d'autres souches plus apparentées. Il n'existe actuellement aucune définition d'espèce universellement acceptée dans le contexte de la bactériologie, malgré de nombreuses tentatives (van Belkum et al., 2007).
D'autres définitions connexes sont clone, souche, isolat et type. Un clone désigne un isolat bactérien qui, bien qu'il ait pu être cultivé indépendamment de différentes sources à différents endroits et peut-être à des moments différents, a encore tellement de traits phénotypiques et génotypiques identiques que l'explication la plus probable de cette identité est une origine commune. Une souche est le descendant d'un isolement unique en culture pure, généralement issue d'une seule colonie initiale sur un milieu de croissance solide. Une souche peut être considérée comme un isolat ou un groupe d'isolats qui peuvent être distingués des autres isolats du même genre et de la même espèce par leurs caractéristiques phénotypiques et génotypiques.
EPS (Polysaccharide extracellulaire) Parois cellulaire Membrane cellulaire Flagelle Cytoplasme Plasmide Chromosome
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Un isolat est une population de cellules bactériennes en culture pure dérivée d'une seule colonie. Un type est un isolat bactérien qui peut être attribué à un groupe nommé selon un schéma de typage existant. Les désignations de types visent à faciliter le traitement et la communication des résultats de typage, ainsi que le développement de bases de données (échangeables) pour des études multicentriques rétrospectives et prospectives à long terme, ainsi que des études de surveillance épidémiologique (van Belkum et al., 2007).
En génétique des populations, une population est constituée des membres d'une espèce qui peuvent se croiser, car ils se trouvent dans la même zone géographique. Étant donné que les bactéries ne se reproduisent pas sexuellement, le terme population ne peut pas être appliqué strictement aux bactéries, et les phytobactériologistes utilisent le terme "population d'agents pathogènes" de manière assez vague. Il est même parfois utilisé pour désigner tous les membres d'une espèce ou tout un complexe d'espèces apparentées (Vinatzer & al, 2014).
1.2-Aspects clés de la génétique des populations et de l’épidémiologie
moléculaire
D’un point de vue génétique, la population représente une communauté constituée par l’ensemble des génotypes des individus qui la composent. La population se caractérise donc par un génome collectif ou patrimoine génétique, appelé aussi pool génétique qui est la somme des génotypes individuels pour chacun des gènes. Le pool génétique d’une population présente une continuité à travers les générations, et peut varier au cours du temps. C’est cette évolution que les études de génétique des populations cherchent à comprendre.
Donc, la génétique des populations est une des branches de la génétique, la discipline qui étudie la transmission de l’information héréditaire et son utilisation dans le développement et le fonctionnement des organismes (Taquet, 2007). Les fondements de la génétique des populations est la diversité génétique, considérant les individus en interactions avec leur environnement (Fleury, 2003).
De cette façon la génétique des populations essaie de comprendre les processus évolutifs qui façonnent et maintiennent la variation génétique au sein et entre les populations. A cet effet la génétique des populations a joué un rôle important, en étudiant la variabilité génétique présente dans et entre les populations avec 3 principaux objectifs : (i)- mesurer la variabilité génétique, appelée aussi diversité génétique, par la fréquence des différents allèles d’ un même gène ; (ii)- comprendre comment la variabilité génétique se transmet d’une génération à l’autre ; (iii)-
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comprendre comment et pourquoi la variabilité génétique évolue au fil des générations (Fleury, 2003; Milgroom & Peever, 2003).
La génétique des populations peut également être défini comme l'étude de la distribution dans l'espace et dans le temps des fréquences alléliques résultant de certaines forces ou processus d'évolution et de façon générale tente de répondre à la question de comment et pourquoi l’information génétique évolue-t-elle au cours du temps au sein des espèces et des populations (Cuguen, 2007, Carbone & Kohn, 2004; Milgroom, 2015).
La connaissance de la génétique des populations d'agents phytopathogènes est importante pour comprendre l'épidémiologie, l'écologie et la trajectoire d'évolution des maladies, pour utiliser efficacement les cultivars résistants et les produits agrochimiques et donc pour contrôler de manière substantielle les maladies des plantes (Zhan, 2016). Aussi la plupart des parasites ne peuvent pas être étudiés par des méthodes directes et leur biologie doit être évaluée par des moyens indirects, notamment à l'aide de marqueurs moléculaires (De Meeus et al., 2007), alors on parle d’épidémiologie moléculaire.
Elle permet de décrire la dynamique évolutive et épidémiologique d’un agent pathogène en relation avec son hôte dans différents environnements. C’est une approche qui est très utilisée en santé humaine, elle est basée sur le typage moléculaire des individus et le pouvoir discriminant de ce typage peut être adapté au niveau de l’échelle analysée, une échelle locale demandant un plus grand pouvoir discriminant (van Belkum et al., 2007).
Cette approche vise à identifier et tracer des espèces, sous-espèces, souches et clones de l’agent pathogène et à suivre leur évolution. Elle a pour but d’évaluer l’impact de la diversité génétique d’un pathogène sur son pouvoir pathogène mais aussi les impacts environnementaux sur les populations. L’épidémiologie moléculaire doit-être une approche répétable, c’est-à-dire que si les manipulations sont effectuées plusieurs fois dans les mêmes conditions les résultats ou profils génétiques obtenus doivent-être identiques ; ainsi que portable, c’est-à-dire que les résultats obtenus doivent-être identiques dans des environnements différents et réalisés par des équipes différentes(Tibayrenc, 1999).
Les objectifs pratiques de l'épidémiologie moléculaire sont d'identifier les microorganismes-parasites (virus, bactéries, champignons, protozoaires,etc..) responsables des maladies infectieuses et de déterminer leurs sources physiques, leurs relations biologiques (phylogénétiques), leurs voies de transmission et celles des gènes et éléments accessoires) responsables de leur virulence, des antigènes pertinents pour les vaccins et de la résistance aux
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médicaments (Levin, Lipsitch, & Bonhoeffe, 1999). Aussi un objectif important de l'épidémiologie moléculaire est de déterminer les mécanismes qui sous-tendent l'émergence des pathogènes (Vernière et al., 2014).
La recherche sur l'épidémiologie des bactéries phytopathogènes a consisté principalement en analyses spatiales et/ou temporelles des schémas pathologiques à différentes échelles (Campbell & Madden, 1990). Une telle épidémiologie quantitative a tendance à ignorer la diversité génétique et phénotypique des agents pathogènes. Somme toute, l’épidémiologie bactérienne est l’étude de la dissémination d'agents pathogènes bactériens, y compris leurs modes de transmission, facteurs de risque et de contrôle des maladies infectieuses dans les populations cibles (végétales, humaines, etc.)
1.2.1-Forces évolutives qui influencent la génétique des populations
En génétique des populations il est utile de faire la distinction entre les deux types de diversité génétique qui contribuent à la structure génétique : la diversité des gènes et la diversité des génotypes. La diversité génétique désigne le nombre et la fréquence des allèles au niveau des loci individuels dans une population. La diversité génétique s'accroît à mesure que le nombre d'allèles augmente et que les fréquences relatives de ces allèles deviennent plus égales. La diversité génotypique désigne le nombre et la fréquence des génotypes multilocus, ou des individus génétiquement distincts, dans une population. Cette diversité est un concept important pour les agents pathogènes des plantes qui ont une composante significative de reproduction asexuée dans leur cycle de vie (McDonald & Linde, 2002).
Les forces évolutives sont les processus qui agissent sur les changements de fréquences alléliques qui affectera par conséquent la diversité génétique (Cuguen, 2007). Cette variation de la diversité génétique des agents phytopathogènes résulte de l'interaction entre mutation, flux génétique, recombinaison, dérive génétique aléatoire et sélection naturelle sous les influences collectives des caractères biologiques des hôtes et des agents pathogènes, des environnements, des pratiques agricoles et des activités humaines (Zhan, 2016). Il s’agit de la mutation, migration, sélection et dérive génétique.
La mutation est la source fondamentale de variation génétique qui correspond à un changement
héréditaire dans le matériel génétique. En exemple on peut avoir des : (i) mutations géniques (changement dans la séquence nucléotidique: mutations ponctuelles, indels (insertions ou délétions d'une ou plusieurs paires de bases), transposons ; (ii) mutations chromosomiques
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(réarrangements chromosomiques: inversions, translocations) ; (iii) mutation génomiques (polyploidisations) ; (iv) autres types (mutation somatiques/germinales chez les métazoaires ;mutation neutre/silencieuse, sans impact sur le phénotype ;mutation favorable/délétère, dépendant des conditions du milieu) (Zhan, 2016).
La migration est l’échange d’individus (ou de gamètes) entre des sous-populations (qui
peuvent présenter des différences génétiques), permettant les flux de gènes entre elles (Patillon, 2014). C’est un mouvement des organismes entre population au sens strict, qui peut être au sens large assimilé à un mouvement des gènes entre populations (flux de gènes). En exemples : (i) chez les animaux, les mouvements des individus, des gamètes en milieu aquatique ; (ii) chez les plantes le mouvement des graines et du pollen.
Le flux de gènes augmente la variation génétique des populations locales, mais diminue la différenciation des populations. Le principal déterminant du flux génétique est le mécanisme de dispersion des agents pathogènes des plantes (Zhan, 2016).
La sélection c’est une force évolutive, induit par les changements de fréquences alléliques. En
exemple une augmentation en fréquence des allèles qui améliorent la survie et la reproduction, conduit donc à une meilleure adaptation (locale et temporaire) des organismes à leur environnement. Pour différentes populations d’une espèce, on peut avoir dans des environnements très différents, une sélection divergente (différenciation génétique des populations liées à différente adaptation pouvant mener à la spéciation). Cependant dans des environnements similaires, les effets homogénéisant de sélection s’opposant à la dérive génétique, sont qualifié de sélection stabilisatrice. Cette force évolutive est, telle que proposée par Charles Darwin (Darwin, 1859), le mécanisme majeur de transformation et de diversification évolutive des espèces. Elle agit par le tri, au sein d’une population, des individus les mieux adaptés aux contraintes de leur milieu qui, de ce fait, ont une meilleure survie et laissent un plus grand nombre de descendants (fitness augmenté) (Patillon, 2014).
La dérive génétique est le processus évolutif de fluctuations aléatoires des fréquences
alléliques résultant d’un échantillonnage aléatoire parmi les gamètes. Elle est donc la fluctuation aléatoire des fréquences alléliques dans une population de taille finie au cours des générations (Wright, 1931). La dérive génétique est déterminée par la taille effective de la population. Les populations d'agents pathogènes de grande taille effective ont tendance à avoir moins de dérive génétique, donc une plus grande variation génétique et à être plus stable dans le temps (Zhan, 2016).
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1.2.2-Outils d’études de l’épidémiologie moléculaire
Pour comprendre la dynamique spatio-temporelle des individus d’une population bactérienne l’épidémiologie moléculaire utilise la génétique des populations, qui considère l’origine, le maintien et la distribution de la variation génétique des espèces sous l’influence des forces évolutives ( mutation, flux génétique ou migration, recombinaison, dérive et sélection) (Zhan, 2016). Aussi, la détermination de la structure génétique d'une population bactérienne semble être un préalable pour l'étude épidémiologique des maladies infectieuses (Denamur & Picard, 1995).
Par ailleurs, certaines bactéries ont tendance à échanger des morceaux de génomes à travers des mécanismes de conjugaison, transduction et transformation. Ces trois phénomènes qui peuvent générer de la recombinaison brouillent les relations de descendance, il est donc plus compliqué de pratiquer l’épidémiologie moléculaire dans ces cas-là (Lindstedt, 2005) .
Les différentes méthodes de typage, qui permettent de discriminer les isolats bactériens de la même espèce en attribuant un profil génotypique et/ou phénotypique à tous les isolats, sont des outils épidémiologiques essentiels en matière de prévention et de contrôle des infections.
Toutes les sciences sont muables, l’épidémiologie moléculaire ne faisant pas exception à cette règle, elle a évolué à travers le développement de la biologie moléculaire, au gré notamment des progrès dans les techniques de séquençage (allant du simple gène à aujourd’hui des génomes entiers), ont abouti à la mise en évidence de polymorphismes de l’ADN, que ce soit au niveau de séquences codantes, non codantes, intergéniques.
Ces séquences peuvent donc servir de marqueurs génétiques et révéler la diversité génétique dans une population ou une espèce et permettre d’analyser la variation de cette diversité dans l’espace et dans le temps (Toussaint, 2018).
Une des voies pour déterminer la diversité génétique d’un micro-organisme est donc l’estimation de son polymorphisme génétique. Les sources de polymorphismes génétiques utilisés dans le génotypage peuvent comprendre : (i) les mutations ponctuelles, utilisées dans les tests de typage de séquences à plusieurs locus (MLST) et tests de polymorphisme mononucléotidique; ii) insertions et délétions/suppressions («indels»); (iii) la nature et le nombre d'éléments de séquence d'insertion (IS); et (iv) le nombre de répétitions dans un nombre variable de réseaux de répétitions en tandem (VNTR) (Pourcel & Vergnaud, 2011).
Le typage moléculaire appliqué aux bactéries, permet de caractériser des isolats pour élucider leur source et route de propagation. Le typage est une analyse phénotypique et/ou génétique des
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isolats bactériens, au-dessous du niveau des espèces / sous-espèces, effectuée afin de générer des profils spécifiques aux souches / clones ou des jeux de données qui peuvent être utilisés, par exemple, pour détecter ou exclure les infections croisées, élucider les modèles de transmission bactérienne et trouver des réservoirs ou des sources d'infection chez les populations cibles (Belkum et al., 2007). Les critères de qualités d’un typage idéal sont la stabilité durant la période de l’étude, la typabilité (testable sur plusieurs souches), le pouvoir discriminant (estimé grâce à l’indice de diversité de Simpsom), la concordance épidémiologique, la reproductibilité (Hunter, 1990; Kanduma et al., 2003).
Un marqueur moléculaire ou génétique est une portion d'acide nucléique ou le produit d'une partie d'acide nucléique (protéine) de l'organisme examiné (De Meeus et al., 2007). Il
correspond à un fragment d’ADN ou locus déterminé sur le génome et partagé par des individus d’une même espèce, et qui a la vocation d’être transmis de génération en génération.
Il y a certains critères qui qualifient un marqueur comme « idéal », quand ils devraient être suffisamment polymorphe, c-à-d qui présente plusieurs allèles (multiallélique) et varie d’un génome à l’autre (plusieurs variants à un locus donné) permettant de différencier des individus très proches, non épistatique c-à-d le génotype en un locus est indépendant du génotype à d’autres loci, réparti régulièrement dans l’ensemble du génome, neutre (différents allèles ne doivent pas avoir d’effet sur le phénotype de l’individu) et détectable sur un grand nombre d’individus étudiés (de Vienne, 1998 ; Maheswaran, 2004).
1.3-Types de marqueurs moléculaires
Les marqueurs génétiques (Tableau 1) sont divisés en trois catégories différentes (De Meeus et al., 2007):
Les marqueurs cytoplasmiques, correspondent aux loci présents dans les génomes mitochondriaux ou chloroplastiques, qui toutefois ne sont pas recommandés pour les études de génétique des populations, car hérité uniparentalement (typiquement maternel) (Xu, 2005) et pourraient ne pas être neutres (Gerber et al.,2001) et donc ne pas être seulement affectés par des processus démographiques et géographiques.
Les marqueurs nucléaires dominants Ce sont de petites paires d'amorces qui amplifient aléatoirement des portions d'ADN cibles si une correspondance de séquence est trouvée. Comme les marqueurs RAPD concernent une partie aléatoire de l'ADN, il n’y a aucun moyen de savoir si les différents loci impliqués sont équivalents en termes de neutralité et de taux de
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