2.1 Description de Module X
L’approche Module X a été créée dans le but de concevoir de petits peptides modulateurs ayant des propriétés allostériques. Module X reproduit de petites parties des portions extracellulaires flexibles et des boucles des récepteurs. Ces petits peptides vont interagir en s’interposant entre deux sous-unités ou entre deux régions de la même sous-unité qui interagissent par des liens hydrogènes, des ponts salins ou des liens disulfure.
Ces régions sont spécialement choisies à l’extérieur du domaine de liaison du ligand orthostérique et sont situées dans les régions inter domaines, la portion juxtamembranaire ou dans les boucles (Figure 8).
A) B)
Figure 8. Choix des peptides A) les régions sont choisies dans les parties flexibles de
la portion extracellulaire de la protéine. B) Un petit peptide d’environ 8 à 10 acides aminés est dérivé de la structure primaire.
2.2 Hypothèse à la base de la conception de Module X
Comme il a été décrit plus haut, les récepteurs existent dans un ensemble dynamique où il y a équilibre entre plusieurs états actifs et inactifs dépendant de l’environnement moléculaire de la protéine. Il y a habituellement un état favorisé thermodynamiquement (par exemple lorsque le ligand se lie l’état permettant la signalisation est favorisé).
Étant donné que les boucles sont exposées durant les changements de conformation, notre hypothèse serait qu’une séquence peptidique reproduisant certaines régions de ces boucles pourrait s’insérer à un endroit approprié dans la structure où se lier à son partenaire de signalisation dans le complexe protéique ce qui aurait comme effet de déplacer l’équilibre de l’ensemble vers un état particulier et modulerait la signalisation. De cette façon, certaines voies de signalisation pourraient être partiellement inhibées tandis que d’autres voies ne seraient pas touchées puisque le ligand orthostérique pourrait toujours se lier au récepteur.
2.3 Méthodologie de Module X
La première étape du processus de conception des peptides par la technologie Module X a été de vérifier si des données structurales (cristallographie et RMN) sont disponibles pour le récepteur cible choisi. Dans le cas où la structure tridimensionnelle n’a pas été résolue, il a été nécessaire de trouver une structure référence possédant la meilleure résolution qui permettra la modélisation par homologie.
Pour modéliser la structure, nous avons utilisé plusieurs algorithmes et méthodes de calcul tel que MOE (Molecular Operating Environment) et FUGUE (69). Étant donné que plusieurs structures références pourraient être nécessaires pour générer un modèle il était important que le paramètre « Z » qui représente la précision du modèle soit élevé.
La structure a ensuite été visualisée à l’aide de logiciels comme PyMol et MOE.
Les structures flexibles telles les boucles et les régions inter domaines ont ensuite été identifiées. De façon à valider la structure générée, nous avons exécuté différentes analyses de flexibilité et d’hydrophobicité à l’aide de Protscale, Predict Protein, Prosite, ProDom et PHDhtm (70-76). Ces analyses ont permis de confirmer les limites des différents domaines et la localisation des boucles dans la structure et de supporter le choix des séquences de nos peptides (Figures 8-9).
Figure 9. Exemple de structures flexibles choisies pour la conception des peptides avec Module X.
Une analyse BLAST (73) était ensuite effectuée pour s’assurer de la spécificité de nos séquences.
2.4. Peptides utilisés pour moduler l’activité biologique :
L’utilisation de peptides dérivés de séquences de protéines a auparavant été utilisée avec succès pour moduler l’activité biologique des protéines. Le tableau 2 présente plusieurs de ces études. Certains de ces peptides ont démontré des propriétés allostériques (77, 78). Module X utilise une combinaison de toutes ces approches en ciblant de plus, les interactions intramoléculaires. Une autre différence majeure est que Module X n’utilise que de petits bouts de séquences et non une région protéique complète.
Tableau 2 Peptides développés à partir de séquences primaires de protéines
Peptides inhibant les interactions protéines-protéines
Description Activité biologique Référence
Ac-VZV-R2
C-terminal de la sous unité 2 réductase : Inhibe l’entrée du
virus Gaudreau P et coll. 1992(79)
Peptide dérivé de HLA classe 1 Inhibe fonction des cellules T en se liant à HSP70 Nossner E et al 1996(80) Peptide dérivé de Fc epsilon R1 Inhibe l’interaction du récepteur avec IgE McDonnell JM et al 1996(81)
Peptides dérivés de LFA-1 et ICAM-1
Inhibe l’interaction entre les
deux protéines Tibbetts, SA et al 2000(82) Petits peptides dérivés du
peptide b-amyloïde Inhibe l ‘agrégation du peptide Chalifour RJ et al 2003(83)
Peptides dérivés des régions juxtamembranaires de récepteurs
Peptides dérivés du récepteur
PGF2a Inhibe l’activité biologique Péri KG et al 2002(77) Peptides dérivés du récepteur
CCR5 (N-terminal) Inhibe l’entrée du HIV Khurana S et al 2005(78)
Peptides dérivés de régions transmembranaires de récepteurs
Peptide dérivé du récepteur de la dopamine D2 – domaine
transmembranaire 7 (GPCR) Inhibe l’activité biologique George SR et al 2003(84) Peptide dérivé du récepteur B-
adrénergique – domaine transmembranaire 6 (GPCR)
Inhibe la dimérisation et
l’activation du récepteur Hébert TE 1996(85) Peptide dérivé du récepteur de
cellules T (récepteur à un seul
domaine transmembranaire Inhibe l’activation des cellules T Huynh NT et al 2003(86) Peptides dérivés de Erb 2-
récepteur tyrosine kinase (RTK) Inhibe l’activité RTK Bennasroune A et al 2004(87) Peptides dérivés du récepteur de
l’insuline — tyrosine kinase (RTK)
Inhibe l’activité RTK Bennasroune A et al 2005(88) Peptides dérivés du récepteur
FGFR3 — tyrosine kinase
(RTK) Inhibe l’activité RTK Lijiran HE 2010(89)
Deux types de récepteurs structurellement différents ont été choisis comme prototypes pour la preuve de concept de Module X. Les récepteurs de cytokines (petites protéines régulatrices du système immunitaire) possèdent tous au moins deux sous-unités dont une est responsable de la liaison du ligand orthostérique (habituellement nommée sous-unité ) et l’autre est responsable de la signalisation
(sauf exception, par exemple le récepteur du facteur de nécrose tumoral qui est un homotrimère). Certains récepteurs partagent la même sous-unité signalisatrice, mais chaque cytokine lie sélectivement une sous-unité qui lui est propre. Ces sous-unités ne possèdent qu’un seul domaine transmembranaire.
Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) quant à eux, sont formés d’une seule chaîne d’acides aminés dont le repliement et l’insertion dans la membrane plasmique permettent la formation de sept domaines transmembranaires. Contrairement aux récepteurs de cytokine, une seule protéine lie le ligand et la protéine G correspondante (complexe intracellulaire) qui médiera la fonction.