Modulation de la présentation de l’Ag restreinte au CMH I grâce au ciblage des

La question de la capacité de ligands des HS à améliorer la présentation des Ag a été adressée dans différentes études qui ont permis de montrer que ces systèmes sont efficaces in

vitro et in vivo pour permettre l’activation de cellules T cytotoxiques (Kim et al. 1997 ;

Shibagaki et Udey, 2002;Batchu et al., 2005). Dans cette étude, nous avons souhaité établir si ce type de ciblage permet également de moduler la présentation croisée des Ag sous forme de complexes immuns, médiée par les récepteurs Fc, comme c’est le cas dans le cadre de la présentation restreinte au CMH de classe II (Léonetti et al., 2010).

Pour étudier cette question, nous avons examiné si la présentation d'une protéine antigénique modèle contenant un épitope T restreint au CMH de classe I engagée dans un complexe immun varie quand celle-ci est couplée de façon covalente à un ligand d’HS. Comme dans l’étude précédente, nous avons utilisé la toxine α de Naja nigricollis comme Ag modèle, auquel nous avons associé un épitope TCD8+ de séquence SIINFEKL issu de l’ovalbumine. Pour le ciblage des HS, nous avons sélectionné la région 47-57 de la protéine Tat du VIH-1 correspondant à la région basique, identifiée comme étant le domaine minimal de transduction médiée par la liaison aux HS (Brooks et al., 2010).

Nous avons analysé la capacité T stimulante de ces constructions in vitro, grâce à un test de présentation impliquant la lignée de cellules dendritiques murine Jaws II utilisées comme cellules présentatrices, et des splénocytes de souris de la lignée OT-1 spécifiques du peptide SIINFEKL présenté dans le contexte H2Kb . La méthodologie complète de ce test est décrite dans la partie finale de ce manuscrit consacrée aux procédures expérimentales.

136 1 10 100 1000 10000 0 50000 100000 150000 200000 - S IINF E K L - S IINF E K L + anti- - S IINF E K L- Tat- 4757 - S IINF E K L- Tat47- 57 + anti-

C o n cen t r at io n en Ag ( n M )

c

p

m

Figure 30 Présentation croisée d’Ag couplés ou non à un fragment capable de lier les HS sous forme libre ou sous forme de complexes immuns

Des cellules JawsII (30 000 cellules / puits) on été incubées avec des dilutions de toxine α- SIINFEKL ou α-SIINFEKL-47–57, en présence ou en absence de 50nM d’anticorps polyclonal de lapin anti-α. Après 5 heures d’incubation, les cellules ont été lavées et fixées avec du glutaraldhéhyde à 0,008% et des splénocytes de souris de la lignée OT-1 (90 000 cellules / puits) ont été ajoutés. Après 3 jours d’incubation, la prolifération des splénocytes a été mesurée. Des résultats similaires ont été observés dans trois expériences indépendantes.

Comme on peut le voir sur la Figure 30, la présence du déterminant Tat47-57 confère à l’Ag une capacité de présentation accrue d’un facteur 25. Ces résultats sont conformes avec les données de la littérature indiquant que la présence d’un déterminant de type CPP accroit la présentation croisée des Ag (Kim et al., 1997). De la même manière, et également en conformité avec les données de la littérature, on observe que la présentation croisée des Ag est plus importante lorsque ces derniers sont engagés dans des complexes immuns (Regnault et al., 1999). De manière intéressante, on observe que la présence du déterminant Tat47-57 permet d’accroitre la présentation de l’Ag sous forme de complexe immun d’un facteur 27. En fait, le ciblage simultané des HS et des récepteurs Fc par les complexes immuns comprenant le déterminant Tat47-57 procure une synergie d’effet et permet d’accroitre la présentation croisée de l’Ag d’un facteur 145 par rapport à l’Ag libre dépourvu du déterminant Tat47-57.

Afin de déterminer si l’effet synergique du ciblage simultané des HS et des récepteurs Fc à la surface des CPA est associé à une augmentation de la liaison des Ag sur les cellules,

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nous avons comparé la capacité de liaison de complexes immuns comprenant ou non le déterminant Tat47-57 sur des cellules Jaws II d’une part, et des splénocytes d’autre part, par cytométrie en flux. Nous avons également évalué la spécificité du ciblage des HS et des récepteurs Fc grâce à des expériences de compétition avec un excès d’héparine libre et/ou d’anticorps bloquant spécifiquement les récepteurs Fc CD16/CD32 (2.4G2).

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A

B

0.1 1 10 100 1000 10000 0 10 20 30 40 -SIINFEKL -SIINFEKL-Tat47-57 concentration antigene (nM) x g e o m e a n 1 10 100 1000 0 20 40 60 80 -SIINFEKL -SIINFEKL-Tat47-57 concentration antigene (nM) x g e o m e a n

C

HS 2.4G 2 HS +2 .4G2 HS _2.4G2 HS + 2.4G2 10 15 20 25 x g e o m e a n -SIINFEKL -SIINFEKL-Tat47-57

Figure 31 Liaison de complexes immuns contenant ou non un fragment capable de lier les HS sur différents types cellulaires

Des cellules JawsII (A) (1,5. 105 cellules / puits) ou des splénocytes de souris C57/Bl6 (B) (2. 105 cellules / puits) ont été incubées dans des plaques de polypropylène avec des séries de dilution de α-SIINFEKL ou α–SIINFEKL-Tat47-57, en présence de 25nM d’anticorps polyclonal de lapin anti-α. Après 1 heure d’incubation à 4°C, les cellules ont été lavées et incubées pendant 30 minutes avec un fragment F(ab)’2 polyclonal anti-lapin couplé au FITC.

La liaison des complexes immuns à la surface des cellules a été révélée par cytométrie en flux. Afin d’étudier le rôle de la liaison aux HS et des récepteurs Fc, α-SIINFEKL et α– SIINFEKL-Tat47-57 (1µM final) ont été incubés avec l’anticorps polyclonal de lapin anti-α (25nM final), en présence ou en absence d’un excès d’HS (3µM) et/ou d’ascite d’anticorps anti CD16/CD32 (2.4G2). Les mélanges ont ensuite été incubés avec les cellules JawsII et la liaison a été évaluée comme en A et B (C). Des résultats similaires ont été observés dans au moins trois expériences indépendantes.

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Comme on peut le voir sur la Figure 31, la capacité de liaison de complexes immuns sur les cellules JawsII (A) comme sur des splénocytes (B) est accrue lorsque ces derniers contiennent le déterminant Tat47-57 capable de lier les HS. La liaison aux cellules du complexe α-SIINFEKL/anti-α est diminuée en présence de l’anticorps anti-récepteur Fc mais pas en présence d’un excès d’HS ce qui indique que les HS n’interviennent pas dans la liaison de ce complexe immun aux cellules, et que celle-ci est spécifiquement médiée par le récepteur Fc. En revanche, la liaison du complexe -SIINFEKL-Tat47-57/anti-α. est diminuée en présence d’un excès d’HS ou d’anticorps bloquant les récepteurs Fc, ce qui indique que la capacité à lier les HS et le récepteur Fc jouent un rôle dans l’interaction de ce complexe avec les cellules. La liaison est encore plus diminuée quand les HS et l’anti-récepteur Fc sont incubés conjointement, ce qui indique que la liaison d’ -SIINFEKL-Tat47-57/anti-α résulte de la capacité à lier les HS et de l’interaction avec le récepteur Fc.

L’activation efficace des cellules T nécessite non seulement que l’Ag soit présenté aux cellules T sous la forme d’un peptide associé à une molécule CMH I, mais également que la délivrance de ce stimuli soit associé à des signaux de co-stimulation (Bennett et al., 1997). Afin d’évaluer la capacité du ciblage simultané des HS et des récepteurs Fc à activer la maturation des DC, nous avons exposé les cellules JawsII à des séries de dilution d’ - SIINFEKL couplé ou non à Tat47-57, en présence ou en absence d’anticorps anti-α pendant 24h. Nous avons ensuite analysé l’expression des marqueurs de maturation CD80 et CD86 à la surface des cellules.

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A

B

10 100 1000 10000 5 6 7 8 9 10 Concentration Ag (nM) x g e o m e a n 10 100 1000 10000 10 12 14 16 18 Concentration Ag (nM) x g e o m e a n

Figure 32 Maturation des cellules JawsII en réponse à l’exposition à des Ag couplés ou non à un fragment capable de lier les HS

Des cellules JawsII (2. 105 cellules / puits) ont été incubées avec des dilutions d’α-SIINFEKL ou α-SIINFEKL-Tat47–57, en présence ou en absence de 25nM d’anticorps polyclonal de lapin anti-α. Après 24 heures d’incubation, les cellules ont été lavées et incubées pendant 30 minutes à 4°C avec l’anticorps anti-CD80-FITC (A) et l’anticorps anti-CD86-FITC(B) puis analysées par cytométrie en flux. Des résultats similaires ont été observés dans deux expériences indépendantes.

Comme on peut le voir sur la Figure 32A, l’expression du marqueur de co-stimulation CD80 est augmentée à la surface des cellules JawsII lorsque celles-ci sont exposées à des Ag capables de cibler les HS (α-SIINFEKL-Tat47–57) ou les récepteurs Fc (α-SIINFEKL/anti-α) à la surface des cellules. Nous n’avons pas observé cet effet pour le marqueur CD86, pour lequel les niveaux d’expression ne varient pas de façon significative en réponse à α- SIINFEKL-Tat47–57 comme α-SIINFEKL/anti-α par rapport à l’Ag α-SIINFEKL dépourvu de toute capacité de ciblage (Figure 32 B). Cependant, le complexe α-SIINFEKL-Tat47– 57/anti-α se montre capable d’augmenter significativement le niveau d’expression de ce marqueur (Figure 32A) ainsi que celui de CD80 (Figure 32 B). Ces résultats indiquent que le ciblage simultané des récepteurs Fc et des HS procure un effet synergique sur la maturation des DC. Ce phénomène de maturation des DC pourrait permettre une activation plus efficace des cellules T et ainsi contribuer à l’augmentation de la présentation croisée de l’Ag que nous avons précédemment observée.

10 100 1000 10000 5 6 7 8 9 10 -SIINFEKL -SIINFEKL-Tat47-57 -SIINFEKL+anti- -SIINFEKL-Tat47-57 + anti- Concentration Ag (nM) x g e o m e a n

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2.3. Applications vaccinales du ciblage simultané des HS et des récepteurs

Dans le document Étude de la propriété adjuvante de la protéine Tat du VIH-1 et utilisation de sa capacité à lier les héparanes sulfates pour évaluer le rôle de cibles ubiquitaires dans les mécanismes de présentation antigénique : implications dans l'immunogénicité de pro (Page 154-160)