Modulation de l'expression de PCNA au cours de l’apoptose du polynucléaire neutrophile

Le polynucléaire neutrophile est une cellule qui apoptose spontanément et la régulation de son apoptose est indispensable dans les mécanismes de résolution de l'inflammation. Le laboratoire s’intéresse depuis de nombreuses années aux mécanismes régulant l'apoptose du polynucléaire neutrophile. Nous allons donc explorer le rôle de cette protéine PCNA, connue pour ses fonctions essentiellement nucléaires, et étonnamment retrouvée dans le cytosol des polynucléaires neutrophiles.

Pour cela, les polynucléaires neutrophiles sont incubés 0, 1, 3 et 15 heures à 37°C en présence ou non d’anti-Fas ou de gliotoxine. L’apoptose induite par des drogues est dite pharmacologique, celle induite par l’anti-Fas mime une apoptose passant par les récepteurs de mort tandis que la gliotoxine simule une apoptose touchant la voie mitochondriale en inhibant la voie NFB. Les doses utilisées pour l’anti-Fas et la gliotoxine sont respectivement 1 µg/mL et 0,1 µg/mL. L’apoptose est analysée par cytométrie en flux (marquages annexine-V / 7AAD et DIOC6) (Figure 26 A, B et D) et par dosage colorimétrique de l’activité des caspases-3 et -8 et -9 (Figure 26 C). L’anti-Fas ou le CD95 et la gliotoxine potentialisent l’apoptose du polynucléaire neutrophile en augmentant l’externalisation de la phosphatidylsérine, la dépolarisation de la membrane mitochondriale et l’activité des caspases-3 et -8. Cet effet augmente en fonction du temps quelle que soit l’apoptose induite, physiologique ou pharmacologique. L’activité de la caspase-9 n’est pas réellement modulée au cours du temps ni en fonction de l’apoptose induite. Notons également que l’échelle est beaucoup plus faible que pour l’absorbance des caspases -3 et -8.

50 Figure 26 : Modulation de l’apoptose des polynucléaires neutrophiles par l’anti-Fas et la

gliotoxine

Les polynucléaires neutrophiles incubés 15 heures à 37°C en présence ou non d’anti-Fas ou de gliotoxine sont passés en cytométrie en flux après un marquage annexine-V / 7AAD (A) et un marquage DIOC6 (D). Une cinétique 1, 3 et 15 heures à 37°C est ensuite réalisée. Les histogrammes représentant les pourcentages de cellules annexine-V positive (B) et les absorbances reflétant l’activité des caspases -3, -8 et -9 (C) montrent une potentialisation de l’apoptose par l’anti-Fas et la gliotoxine. Ces expériences ont été réalisées trois fois.

Nous avons ensuite étudié l’expression de la protéine PCNA au cours de ces différentes apoptoses (Figure 27). Pour cela, dans les mêmes conditions que précédemment, nous réalisons des culots secs de polynucléaires neutrophiles. La fraction cytosolique est obtenue par sonication car le nombre de polynucléaires neutrophiles par condition ne nous permet pas d'utiliser la méthode de la cavitation à l'azote. Le protéines sont dosées par la méthode du Biuret. La révélation du Western blot montre une diminution de l’expression de PCNA au cours de l’apoptose du polynucléaire neutrophile. Plus l’apoptose est importante, plus PCNA disparaît.

Figure 27 : Expression de PCNA au cours de l’apoptose du polynucléaire neutrophile Les polynucléaires neutrophiles à l’état basal (CT) et incubés 1, 3 ou 15 heures à 37°C avec ou sans 1µg/mL d’anti-Fas ou 0,1 µg/mL de gliotoxine sont soniqués puis la fraction soluble est analysée. 50 µg de protéines sont déposées sur un gel de polyacrylamide (12,5 %). La révélation est faite avec l’anti-PCNA pc10 dilué au 1/1000.

Afin de valider la charge déposée sur le gel, une révélation avec l’anti-actine (Sigma, A2066) est effectuée. Elle montre une quantité similaire dans chaque puits.

PCNA est donc dégradé au cours de l’apoptose du polynucléaire neutrophile. Afin de comprendre les mécanismes de cette dégradation, nous avons étudié l’effet des inhibiteurs suivants : le zVAD (inhibiteur des caspases), le Pefabloc (PF, inhibiteur des sérines protéases), le PD150606 (inhibiteur des calpaïnes) et le ps341 (inhibiteur du protéasome). Nous utilisons les mêmes techniques que précédemment : les polynucléaires neutrophiles sont incubés avec ou sans zVAD (50 µM), Pefabloc (50 µM), PD150606 (1, 5 ou 10 µM) ou ps341 (0,1 ou 1 µM) pendant 16 heures à 37°C. Le lendemain, un marquage annexine-V / 7AAD est réalisé pour évaluer l’apoptose ainsi que des culots secs pour chaque condition

(Figure 28 A et B). Ces derniers sont soniqués et la fraction soluble est analysée sur gel

d’acrylamide. Le contrôle (CT) correspond à des polynucléaires neutrophiles fraîchement isolés du sang.

Les résultats pour l’apoptose sont exprimés en pourcentage de cellules en survie, donc annexine-V négative. Le Pefabloc diminue significativement la survie des polynucléaires neutrophiles. En revanche, le zVAD et le ps341 augmentent cette survie par rapport à l’apoptose physiologique. L’inhibiteur des calpaïnes ne module pas l’apoptose des polynucléaires neutrophiles (donnée non montrée). Lorsque nous étudions l’expression de PCNA par western blot, la corrélation existe : PCNA est stabilisé avec zVAD et ps341, complètement dégradé avec Pefabloc et non modulé avec PD150606.PCNA est donc dégradé par le protéasome durant l’apoptose physiologique du polynucléaire neutrophile.

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Nous avons voulu savoir ce qu’il en était pour les apoptoses induites par l’anti-Fas et la gliotoxine (Figure 28 C). PCNA est également dégradé par le protéasome au cours de ces deux apoptoses pharmacologiques.

Le Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) est un facteur puissant capable d'induire la survie des polynucléaires neutrophiles. C'est un facteur de croissance qui permet d’augmenter spécifiquement le taux de polynucléaires neutrophiles. Nous traitons les polynucléaires neutrophiles avec 10 ou 25 ng/mL de G-CSF pendant 16 heures à 37°C et une protection de l’apoptose est observée (Figure 28 E). L’expression de PCNA est alors stabilisée par western blot (Figure 28 D). L'analyse des ARN messager dans les polynucléaires neutrophiles de patients traités par le G-CSF réalisé par nos collaborateurs ont ensuite montré qu'aucune synthèse d'ARN de PCNA n'était observée au cours du traitement par G-CSF contrairement à d'autres protéines dont l'ARN est fortement induit (comme l'Interleukine 1, IL-1) (données non montrées).

Figure 28 : Modulation de l’expression de PCNA

(A) Les polynucléaires neutrophiles traités avec zVAD, Pefabloc ou ps341 sont marqués avec l’annexine-V / 7AAD et l’apoptose est analysée par cytométrie en flux. 50 µg de protéines cytosoliques de polynucléaires neutrophiles plus ou moins traités ont été séparés selon leur poids moléculaire dans un gel SDS de 12,5%. Phy = apoptose physiologique (incubation 18 heures à 37°C). Résultats significatifs obtenus sur 5 expériences indépendantes (* = p<0.05, ** = p<0.005).

(B) 50 µg de protéines cytosoliques de polynucléaires neutrophiles plus ou moins traités avec l’inhibiteur des calpaïnes PD150606 ont été analysés par Western blot.

(C) 50 µg de protéines de polynucléaires neutrophiles apoptotiques (par anti-Fas ou gliotoxine) traités ou non avec ps341 ont été analysés par Western blot. Les révélations ont été faites avec un anticorps anti-PCNA pc10. Une coloration à l’or colloïdal est également réalisée pour vérifier la quantité de protéine chargée par puits.

(D) 50 µg de protéines cytosoliques de polynucléaires neutrophiles plus ou moins traités avec G-CSF ont été analysés par Western blot.

Les révélations ont été faites avec un anticorps anti-PCNA pc10 et un anti-actine (Sigma, A2066). (E) Les polynucléaires neutrophiles traités avec G-CSF (10ng/mL) sont marqués avec l’annexine-V / 7AAD et l’apoptose est analysée par cytométrie en flux. Résultats significatifs obtenus sur 6 expériences indépendantes (* = p<0.05, ** = p<0.005).

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