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Diversas substâncias químicas são capazes de provocar uma resposta hormonal em organismos, sendo determinadas substâncias com atividade estrogênica. O termo

Estrogenicidade é definido como a propriedade de produzir respostas biológicas

qualitativamente semelhantes aos hormônios endógenos, como o 17--Estradiol (DASTON, et al., 1997).

Grande parte dos estudos relacionados a estrogenicidade de substâncias utiliza linhagem celular de adenocarcinoma mamário humano, conhecidas como MCF-7. A popularidade dessa linhagem é em grande parte devido à sua requintada sensibilidade hormonal por meio da expressão do receptor de estrogênio (ER), tornando um modelo ideal para as pesquisas de resposta hormonal (LEVENSON e JORDAN, 1997), onde a estrogenicidade da substância-teste é diretamente mensurada com a indução da proliferação celular proporcionada (ICCVAM, 2007). Os receptores de estrogênio- e - se ligam facilmente à uma infinidade de substâncias químicas ou naturais, incluindo os IE, provocando a transcrição de genes que respondem ao estrogênio, o que leva à proliferação celular; é dessa forma que o ensaio II E-screen determina com precisão a atividade estrogênica de uma substância (ICCVAM, 2007).

Utilizando deste recurso analítico, os pesquisadors Wagner e Oehlmann (2011) mostraram em sua pesquisa sobre a presença de atividade estrogênica em água mineral e suas respectivas embalagens (PET, vidro e longa vida), que existem rotas de exposição à essas substâncias pouco exploradas. Ainda segundo os autores, o entendimento da complexidade da exposição humana aos IE é prejudicado pelo número excessivo dessas substâncias e limitações nas técnicas para sua detecção. O trabalho apresentou dados preocupantes a respeito da estrogenicidade de embalagens e como estas podem contaminar o seu conteúdo,

nesse caso água mineral. A Figura 4.6 apresenta os valores de proliferação das células MCF- 7 em contato com as amostras. As 18 amostras foram coletadas aos pares da mesma fonte, porém com diferentes embalagens. Nota-se que as amostras em PET apresentaram maiores índices de proliferação celular, consequentemente maior atividade estrogênica, seguida pela embalagem longa vida e vidro. Os autores consideram que o plástico presente na embalagem PET seja o responsável pelos resultados; também a mistura de materiais da embalagem longa vida (plástico, alumínio e papel) e possíveis contaminações no processo de engarrafamento ou mesmo na fonte mineral para a embalagem de vidro. A letra C da figura indica o grupo controle do teste e os asteriscos são: ** p>0,01, *** p>0,001.

Figura 4.6: Proliferação Celular em Amostras de Água Mineral de Diferentes Embalagens

(Fonte: adaptado de Wagner e Oehlmann, 2011)

A expressiva redução da atividade estrogênica de Bisfenol – A e Nonilfenol usando as enzimas Lacase e Manganês Peroxidase foram avaliadas pelo método da cepa recombinante com afinidade a elementos de resposta estrogênica desenvolvida por Nishikawa (1999). Os resultados apresentados mostram que a Lacase proveniente do cultivo de Trametes versicolor, juntamente com um sistema mediador, foi capaz de reduzir a estrogenicidade de 0.88 mM de Bisfenol – A a 20% de atividade remanescente e a 10% para 0.92 mM de Nonilfenol em 12 horas de tratamento; além de reduzir concentração de Bisfenol – A a 70% e 60% a concentração inicial de Nonilfenol, em uma hora de tratamento. No

entanto, Manganês Peroxidase de Phanerochaete crysosporium foi ainda mais eficiente na degradação: removeu completamente as concentrações iniciais dos IE do estudo no mesmo período de tempo; a redução da atividade estrogênica remanescente ficou em 40% para o Bisfenol – A e 60% para o Nonilfenol em três horas de tratamento e quase totalmente removido na extensão do tratamento para 12 horas. Não foram detectadas concentrações ou estrogenicidade resurgentes pelo período de até 48 horas. Desta forma, os autores ressaltam a importância de estudos de redução de atividade estrogênica aliados aos estudos de degradação dessas substâncias, já que os resultados mostram que as enzimas fúngicas podem ser consideradas eficientes em seu tratamento (TSUTSUMI, HANEDA e NISHIDA, 2001). Outra importante descoberta sobre o processo de redução da atividade estrogênica dos IE por Lacases fúngicas livres e imobilizadas foi descrito por Torres-Duarte, Viana e Vazquez- Duhalt (2012): a enzima é capaz de inibir a afinidade de ligação entre as substâncias (17- Estradiol, Bisfenol – A; Triclosan e Nonilfenol) e os receptores estrogênicos alfa humano (hER) e animal (ZfER de Danio rario – Zebrafish), o que automaticamente, diminui a resposta estrogênica. Essa afirmação foi corroborada por Cabana et al., (2007), cuja pesquisa de degradação de Bisfenol – A, Nonilfenol e Triclosan com preparado enzimático relata a modificação química estrutural dos produtos de degradação, tornando-o não ligante aos receptores de estrogênio.

A Lacase também apresenta bons resultados de degradação e redução da atividade estrogênica quando usada para o tratamento de amostras reais. Esse foi o caso do trabalho de Spina e colaboradores (2015), que propuseram um modelo de tratamento para Interferentes Endócrinos presentes no esgoto doméstico da cidade de Turim, Itália, a partir do uso da Lacase de T. pubescens. O estudo avaliou o desempenho da enzima na degradação de vários IE, dentre eles o 4 – Octilfenol e o Bisfenol – A, além da redução da atividade estrogênica. A degradação alcançada atingiu 70% da concentração inicial para a maioria dos IE do estudo, chegando a 95% para o 4 – Octilfenol; além da estrogenicidade ser praticamente anulada, sendo mensurada pelo ensaio E-screen com a linhagem celular MCF-7 Bus, uma variedade mais sensível aos receptores de estrogênios. A Tabela 4.1 apresenta os resultados de estrogenicidade da pesquisa, mostrando que os valores alcançados, após o tratamento com a Lacase, estão abaixo dos resultados comparativos para o parâmetro (grupo controle). Os autores alertam que o risco de contaminação de organismos por esgoto doméstico pode estar subestimado se não houver informações adicionais de bioensaios (E – screen e ensaios toxicológicos), já que a mistura de compostos tóxicos pode ser muito mais nociva que os efeitos somados de cada substância, pois interações químicas diversas podem ocorrer.

Quadro 4.3: Atividade Estrogênica em Amostras de Esgoto Doméstico

E ‐ screen Efeito Proliferativo (%) Estrogênio Equivalente (ng.L‐ 1₎

Antes do Tratamento 99 ± 17 15,7 ± 15,5

Após o Tratamento 64 ± 20 1,7 ± 0,4

Controle 83 ± 13 5,1 ± 1,6