III1 Analyses bioinformatiques des enzymes CrtI et CrtB
Les résidus aux extrémités N ou C terminale des enzymes peuvent être importants pour la fonction enzymatique. Ils peuvent être perturbés par une ingénierie enzymatique impliquant une fusion. Pour comprendre la structure tridimentionnelle des enzymes ainsi connaitre où sont situés les résidus importants pour la fonction des enzymes d’intérêt, des alignements de séquence et des modèles par homologie ont été réalisés.
III.1.1 Modélisation par homologie de CrtI
La gamma désaturase de Nonlabens dokdonensis ou CrtD possède le meilleur pourcentage d’identité avec CrtI (31%). CrtD appartient à une voie de biosynthèse dans laquelle elle catalyse l’ajout d’une insaturation sur des substrats ressemblant au neurosporène, au lycopène ou à l’γ‐carotène mais ayant un groupement hydroxyle (Ahn and Kim, 2015) (figure 29).
Figure 29 : Voie de biosynthèse d’ γcaroténoïdes, tels que le myxol et la saproxanthine dans laquelle agit CrtD par désaturation
en position C3’C4’ du 1OHγcaroténoïde. La position de l’insaturation catalysée par CrtD sur plusieurs substrats est encerclée.
Figure tirée de (Ahn and Kim, 2015).
Des séquences conservées entre la CrtI de X. dendrorhous, la CrtD de Nonlabens dokdonensis, la PDS de O. sativa et la CrtI de P. ananatis sont mises en évidence par une comparaison de leur séquence (figure 30).
Figure 30 : Alignement de séquence de CrtI de X. dendrorhous, de la gamma désaturase de Nonlabens dokdonensis, de la PDS de
O. sativa et de CrtI de P. ananatis. Les résidus de même propriété et conservés sont surlignés avec la même couleur. Des résidus
conservés chez les CrtD et qui sont soit au niveau de la poche hydrophobique ou sont impliqués dans la catalyse sont représentés
par des rectangles violets et rouges respectivement (Ahn and Kim, 2015).
Plusieurs résidus sont conservés aux extrémités N et C terminales des séquences. Des résidus en N terminale sont impliqués dans la liaison au cofacteur (Bartley et al., 1990). Ils forment un motif βαβ (Bartley et al., 1990). Les résidus conservés en C terminale sont retrouvés chez les trois autres types de désaturase. D’autres résidus conservés sont spécifiques aux CrtD et sont répartis ailleurs dans la séquence (figure 30). Ces derniers sont impliqués dans la formation de la poche hydrophobique accueillant le caroténoïde (Ahn and Kim, 2015). Ils sont également impliqués dans le mécanisme catalytique (figure 30). Les différents résidus conservés entre les différentes enzymes sont mis en évidence sur la structure tridimentionnelle de CrtD (figure 31).
Figure 31 : Structure tridimentionnelle de CrtD(4REP). L’image
est vue d’en bas coté membrane. Les extrémités N et C
terminales de la structure sont indiquées. Le FAD est
représenté en sphère jaune. Le motif βαβ intéragissant avec le
FAD est représenté en bleu. Les résidus conservés en C
terminal conservés chez les CrtD et retrouver chez les 3 autres
désaturases sont représentés en rouge. Les autres résidus
conservés chez les CrtD et non retrouvé chez les trois autres
désaturases sont représentés en vert. Une boucle mobile au
niveau de l’entrée du substrat chez les CrtD est représentée en
orange.
Une fusion en N terminale pourrait perturber par exemple les résidus impliqués dans l’interaction avec le FAD (en bleu sur la figure 31). La fonction des résidus conservés en C‐terminale (en rouge sur la figure 31) pourraient également être perturbée par une fusion en C terminale. Comme indiqué précédemment, les substrats des CrtD sont hydroxylés. Des différences sont retrouvées au niveau du canal hydrophobique de CrtD comparé à celui de la PDS. Spécifiquement à CrtD, une boucle hautement flexible (représentée en orange sur la figure 31) à l’entrée du canal permet d’allonger la longueur de la poche mais aussi d’accueillir le cycle β comme dans le 1’‐OH‐γ‐carotène. Cela oriente correctement le reste de la molécule substrat par rapport au FAD et positionne les carbones en position C3’‐C4’ pour la désaturation. Malgré ces différences majeures, l’organisation tridimensionnelle globale de CrtD ressemble aux autres structures de désaturases, à savoir une organisation en trois sous domaine (Ahn and Kim, 2015).
Les structures de la CrtI bactérienne P. ananatis (Schaub et al., 2012a) et celle de la phytoène désaturase de la plante O. sativa se ressemblent (Gemmecker et al., 2015). Lorsqu’on les superpose, les résidus du site actif constituent l’essentiel des différences entre les deux structures (Gemmecker et al., 2015). Cela reflète les mécanismes réactionnels différents (Gemmecker et al., 2015). Un modèle par homologie de CrtI avec la PDS comme modèle est représenté (figure 32B).
Figure 32 : Localisations des extrémités N et Cterminale des
désaturases. A. structure de la PDS avec en bleu, rouge et vert des résidus importants pour la fonction enzymatique B.
modèle de CrtI modélisé à partir de PDS de O. sativa. Les
extrémités N et C terminale des modèles sont indiquées.
Une séquence en C terminale de CrtI de X. dendrorhous est non modélisée. En effet par alignement de séquence, on observe que l’enzyme possède une séquence d’une vingtaine de résidus en C terminale prédite pour former une hélice et absente chez les autres enzymes. Une prédiction de la structure secondaire de cette séquence C terminale en hélice par Phyre indique une hélice transmembranaire. Une autre hélice enfouie au sein de la protéine est aussi prédite comme étant transmembranaire par Phyre (figure 33).
Figure 33 : Modèle de CrtI à partir de CrtD et sur lequel
l’hélice en C terminale non modélisable est représentée.
L’hélice représentée en bleu ciel n’existe pas dans le modèle
par homologie car CrtI posséde 62 résidus en plus par rapport
à CrtD en C terminale de l’enzyme. En jaune doré, une hélice
définie comme transmembranaire par Phyre mais qui se
trouve être enfouie au sein de la protéine.