Modèles transgéniques du gain de fonction toxique de l’ARN muté

Une seconde génération de lignées transgéniques visant à exprimer les répétitions toxiques a grandement permis de disséquer ce mécanisme encore inconnu de maladie.

1.2.1. Souris exprimant le locus DMPK humain

Un premier modèle de souris avec plusieurs insertions du gène humain DMPK contenant seulement 11 répétitions CTG a d’abord été généré (Figure 41) (Jansen et al., 1996).

Les souris DM20, DM300 et DMSXL possèdent 1 à 3 copies du locus DMPK humain avec respectivement 20, ~300-600 et 1000-1800 répétitions CTG.

Gomes-Pereira et al., 2011

Figure 43. Représentation schématique de la construction du transgène des lignées HSA

Les souris HSASR _{et HSA}LR _{portent plusieurs copies du fragment du} gène HSA (Human skeletal actin) contenant dans son exon terminal respectivement 5 ou 250 CTG. 1-20 copies du transgène pour la

Synthèse bibliographique

- 56 - Les souris de la lignée Tg26 présentent une cardiomyopathie et une myotonie des muscles squelettiques associée à une diminution du marquage CLCN1 (Jansen et al., 1996; O'Cochlain et al., 2004). Ce modèle Tg26 ne permet pas de faire la distinction entre l’effet de l’accumulation de courtes répétitions qui pourrait être toxique, et la surexpression de la protéine DMPK.

Un second modèle exprimant le gène DMPK humain muté dans son locus permet de conserver a priori la régulation spatio-temporelle de ce gène. Une première souris homozygote contenant 320 répétitions CTG dans le gène DMPK (DM300, Figure 42) a été générée et présente des foci ribonucléaires dans les muscles squelettiques, le cœur le système nerveux central. Ce modèle DM300 présente des phénotypes clés de la DM1 tels que myotonie, faiblesse musculaire progressive, histopathologie musculaire, trouble du métabolisme du glucose lié à l’âge associé à un défaut d’épissage du récepteur à l’insuline, retard de croissance et mortalité élevée (Seznec et al., 2001; Guiraud-Dogan et al., 2007; Vignaud et al., 2010). Par ailleurs, au niveau du cerveau, la distribution altérée des isoformes des protéines MAPT/Tau (Seznec et al., 2001) ressemble à celle des patients (Sergeant et al., 2001). L’instabilité germinale des répétitions du locus humain a permis de générer des souris dites DMSXL portant >1000 répétitions CTG à partir des souris DM300 (Gomes-Pereira et al., 2007). Les souris hémi ou homozygotes DMSXL expriment les transcrits sens et anti-sens de DMPK humain dans de très nombreux tissus mais plus fortement dans les muscles squelettiques et le cœur (Huguet et al., 2012). De ce fait, des foci sont détectables à la fois avec les sondes sens et anti-sens dans ces tissus. Les souris DMSXL ont une létalité de 60% au cours du premier mois de vie. Les survivantes présentent un retard de croissance, des fibres musculaires plus courtes et moins épaisses, une force musculaire et une performance motrice réduites (Huguet et al., 2012). Au niveau du cerveau, l’expression du transgène entraîne des anomalies comportementales et cognitives, une diminution du niveau de dopamine et de métabolites de la serotonine, ainsi que l’augmentation des protéines des vésicules synaptiques RAB3A et SYN1 respectivement par une augmentation du niveau des transcrits Rab3a suite à la séquestration de MBNL1 et à la phosphorylation de SYN1 par CUGBP1 (Hernandez-Hernandez et al., 2013).

1.2.2. Expression de répétitions non codantes seules

Afin d’évaluer la toxicité des répétitions CTG en dehors de leur contexte, l’équipe de Charles Thornton a utilisé le gène humain HSA (human skeletal actin) pour exprimer #250 CUG non codants dans les muscles squelettiques murins (Figure 43). Les souris transgéniques ainsi générées sont appelées HSALR et ne permettent une étude que du muscle squelettique adulte (le transgène ne s’exprimant pas dans les cellules précurseurs du muscle). L’expression des répétitions CUG non codantes cause une mortalité élevée des lignées ainsi que de la myotonie (Mankodi et al., 2000). D’un point de vue moléculaire, l’expression du transgène entraîne la séquestration de MBNL1 perturbant ainsi l’épissage de Clcn1, Serca1, Mbnl1, Ldb3 (Lin et al.,

L’expression est permise par l’enhancer du cytomegalovirus (CMV) et le promoteur de la ß-actine. La cassette de polyadenylation entre les sites loxP empêche l’expression du transgène en absence de recombinaison. L’administration de Tamoxifène induit la recombinaison par la Cre de manière tissu-spécifique permettant de supprimer la cassette de polyadénylation et favorisant l’expression du transgène.

Gomes-Pereira et al., 2011

Figure 45. Représentation schématique de la construction du transgène des lignées GFP-DMPK-(CTG)n

Les souris GFP-DMPK-(CTG)_n possèdent un élément de réponse à la tétracycline (TRE) dans la région promotrice de DMPK. En aval, la séquence de la GFP est fusionnée à la région 3’ non traduite de DMPK contenant 5 ou 200 répétitions CTG. Ces animaux expriment de manière constitutive le transactivateur inverse de la tétracycline. En présence de doxycycline, le transacticateur se lie au TRE et active l’expression du transgène GFP-DMPK-(CTG)n.

Synthèse bibliographique

- 57 - 2006). Dans ce modèle, MBNL1 co-localise bien avec les foci mais CUGBP1 n’est pas surexprimé dans le muscle squelettique (Lin et al., 2006).

Le système Cre-lox a également été utilisé pour générer une souris qui exprime 960 répétitions CTG interrompues localisées dans l’exon 15 de DMPK sous contrôle du promoteur du gène ß-actine inductible au tamoxifène. Ce modèle est appelé EpA960 (Figure 44). L’expression du transgène dans le cœur ou les muscles squelettiques induit séquentiellement la formation de foci, la séquestration de MBNL1, l’hyperphosphorylation et l’accumulation de CUGBP1 (Kuyumcu-Martinez et al., 2007; Wang et al., 2007; Orengo et al., 2008). Lorsque exprimées dans le cœur, les répétitions induisent des troubles electrophysiques et histopathologiques de la DM1 puis le décès des souris dans les 2 semaines (Wang et al., 2007). Dans les muscles squelettiques, les souris développent de la myotonie, une histopathologie et une dégénérescence progressive du muscle (Orengo et al., 2008). La toxicité potentielle des interruptions des répétitions et la fuite d’expression du transgène sont deux limites de ce modèle.

1.2.3. Expression inductible et réversible de la région 3’ non codante du gène DMPK

Des souris GFP-DMPK-(CTG)n portent un promoteur modifié de DMPK contenant des éléments de réponse à la tétracycline et qui permet l’expression du transcrit de la GFP fusionnée à 5 ou 200 répétitions CTG (Figure 45). Ces animaux expriment aussi de manière constitutive un transactivateur de la tétracycline qui va se fixer sur ses éléments de réponse en présence de tétracycline et activer l’expression du transgène.

Les souris hémizygotes pour le transgène contenant 200 répétitions présentent des foci qui séquestrent MBNL1 mais pas de phénotypes apparents (Mahadevan et al., 2006). Au contraire, les souris exprimant seulement 5 répétitions après induction à la doxycycline ne présentent pas de foci mais développent une myotonie et un électrocardiogramme anormal pouvant progresser jusqu’à la mort subite (Mahadevan et al., 2006). De plus, la surexpression de (CTG)5 induit l’expression du facteur de transcription cardiaque NKX2.5 et de ses cibles dans le muscle squelettique et le cœur de manière réversible lorsque l’on arrête le traitement à la doxycycline (Yadava et al., 2008).

Ce modèle a deux défauts notables. Le premier est la fuite d’expression du transgène qui se traduit par de la myotonie chez les souris non induites à la tétracycline et entraîne leur décès vers l’âge de neuf mois. Le second est que l’on ne peut pas comparer l’effet des différentes tailles de répétitions car l’expression du transgène (CTG)5 est plus importante que celle du transgène (CTG)200, ce qui explique les différences phénotypiques observées entre ces deux lignées.