Modèles de pontage peptide + oligonucléotide

Les oligonucléotides utilisés lors de ces expériences ont été synthétisés par Eurogentec. Le peptide doigt de zinc CP1-Y2F nous a été fourni par Vincent Lebrun et Olivier Sénèque du laboratoire de Physicochimie des Métaux en Biologie (PMB, iRTSV, CEA Grenoble). La thrombine provient de chez Ozyme et la protéine SSB de chez Epicentre. Ces expériences ont été réalisées en collaboration avec Sandrine Perrier du Département de Pharmacochimie Moléculaire (Université Joseph Fourier Grenoble).

8.1 Etude par gelshift après marquage radioactif

8.1.1 Marquage des oligonucléotides par le phosphore 32

Le marquage est effectué sur 10 pmoles d’oligonucléotide. 1 µL d’une solution d’oligonucléotide à 10 µM est ajoutée à 9,6 µL d’eau. On ajoute ensuite 3 µL de tampon de kinase 5X (forward reaction buffer de chez Sigma), 0,1 µL de T4 polynucléotide kinase (Life Technologies, solution d’enzyme à 10 U/µL) et 1 µL d’ATP marqué au phosphore 32 (PerkinElmer). Le mélange est incubé 1h à 37°C, puis 25 µL d’eau sont ajoutés. La solution d’oligonucléotide marquée est ensuite purifié avec une colonne G-25 illustra MicroSpin (GE Healthcare) afin d’enlever l’ATP en excès. On obtient 40 µL d’une solution d’oligonucléotide marqué à 250 nM.

8.1.2 Hybridation avec la séquence complémentaire et formation des G-quadruplex

Une étape d’hybridation est nécessaire pour le système « doigt de zinc CP1-Y2F + duplex 12-mer ». L’oligonucléotide marqué est dilué au 1/500e _{dans une solution d’oligonucléotide « froid » (non}

marqué). On ajoute donc 300 pmoles d’oligonucléotide, dont 0,6 pmoles d’oligonucléotide marqué, à 360 pmoles (1,2 éq.) du brin complémentaire non marqué, dans le tampon 1X qui sera utilisé pour l’expérience de gel shitf. La dénaturation s’effectue à 90°C pendant 2 min, puis l’hybridation se produit lors du refroidissement progressif à température ambiante.

Pour le système « thrombine + aptamère 15-mer » les structures en G-quadruplex sont obtenues également par une étape de dénaturation. La solution d’aptamère dans le tampon 1X utilisé pour la formation des complexe est chauffée à 90°C pendant 5 min, puis refroidie très progressivement à température ambiante.

8.1.3 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide

- Préparation des gels

Les gels utilisés contiennent un mélange d’acrylamide/bisacrylamide (29/1) à 8% (Tableau 2).

Tableau 2 : Composition des gels utilisés pour l'étude des modèles de pontage par PAGE

Gel natif (pour 100 mL) Gel dénaturant (pour 100 mL)

Urée* (Sigma) - 42 g Solution d’acrylamide/bisacrylamide (29/1) à 40 % (Sigma-Aldrich) 20 mL 20 mL TBE 10X (Gibco) 10 mL 10 mL Eau milliQ 70 mL QSP 100 mL

*L’urée est dissoute en agitant à 35°C pendant 1 ou 2 h. La solution est ensuite filtrée sous vide sur verre fritté.

Deux formats de gels ont été utilisés : 33*20 cm (épaisseur 0.5 mm) et 8.0*7.5 cm (épaisseur 1 mm). Les grands gels sont coulés en 2 fois. Le bas du gel est polymérisé à partir de 20 mL de la préparation à base de polyacrylamide, auxquels on ajoute 200 µL d’une solution de persulfate d’ammonium (APS) à 10 g/100 mL (Sigma) et 20 µL N,N,N',N'-tétramethylethylenediamine (TEMED, Sigma). Pour le reste du gel, on utilise 60 mL de préparation de polyacrylamide avec 400 µL de solution d’APS et 40 µL de TEMED. Les petits gels sont coulés en une fois avec 20 mL de préparation d’acrylamide avec 150 µL de solution d’APS et 15 µL de TEMED.

- 1e _{étape : Formation des complexes}

Ø Formation des complexes « doigt de zinc CP1-Y2F + duplex 12-mer »

Les complexes sonts formés par incubation à température ambiante pendant 30 min, dans le tampon suivant : Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 100 mM, ZnCl2 100 µM. L’oligonucléotide duplex (5 µM)

marqué à 0,5 mole% sur l’un des brins est mis en présence de différentes concentrations de peptide (0 à 4 mM) dans un volume total de 10 µL, avec 10 % de glycérol.

Ø Formation des complexes « thrombine + aptamère 15-mer »

100 fmoles d’aptamère marqué à 100 mole% (concentration finale 8,33 nM) sont incubées avec différentes concentrations de thrombine (0 à 1000 nM), dans un volume total de 12 µL, avec 8 % de glycérol, pendant 1h (30 min suffisent pour former les complexes) à température ambiante. Les différents tampons d’incubation utilisés sont listés dans le Tableau 3.

Tableau 3 : Tampons d'incubation utilisés lors de l'étude de la formation des complexes "thrombine + aptamère 15-mer" par gelshift.

Tampon phosphate Tampon de sélection (136) Tampon EMSA classique (180) NaH2PO4/Na2HPO4 20 mM

pH=7,4 KCl 100 mM Tris acétate 20 mM NaCl 140 mM KCl 5 mM CaCl2 1 mM MgCl2 1 mM Tris 20 mM pH=7,4 EDTA 1 mM KCl 100 mM

- 2e _{etape : irradiation (pour le système « doigt de zinc CP1-Y2F + duplex 12-mer »)}

De la riboflavine en solution dans le tampon d’incubation est ajoutée, pour obtenir une concentration finale de 50 µM, juste avant chaque irradiation (les échantillons sont irradiés un par un, dans des eppendorf de 100 µL). L’eppendorf est disposé dans un petit flacon en verre de 2 mL contenant de l’eau froide. L’irradiation s’effectue par une lampe halogène, placée à 20 cm de l’échantillon, pendant 15 ou 30 min.

- 3e _{étape : dépôt et migration}

La pré-migration est effectuée dans un tampon TBE 1X pendant une nuit à 400 V, 10 mA, 3 W. Chaque échantillon est supplémenté de 6 µL de bleu sucrose (sucrose 40%, bleu de bromophénol 0.25%, cyanol xylène 0.25%, TBE 2X dans H2O) et on dépose 7 µL des mélanges obtenus dans les puits (pour cette

expérience le bleu sucrose est déposé uniquement dans un puis séparé). La migration est réalisée dans les mêmes conditions que la pré-migration, pendant 4h30 à 5h.

Pour les expériences réalisées sur petit gel, la migration est effectué à 100V, et la prémigration ne dure que 1h.

- 4e _{étape : analyse des gels}

Après la migration, le gel est démoulé et exposé pendant une nuit contre une plaque (Kodak) sensible au rayonnement émis par le phosphore-32. La lecture de la plaque est effectuée le lendemain à l’aide d’un appareil Personal Molecular Imager FX (Bio-Rad). Le logiciel Quantity One (Bio-Rad) est utilisé pour l’analyse de l’image de gel.

8.2 Etude par HPLC-MS/MS

- Etape d’incubation pour le système « thrombine + aptamère 15-mer »

Après dénaturation, l’aptamère 15-mer à une concentration de 20 µM est incubé avec 10 µM de thrombine, à 37°C pendant au moins 30 min. Le tampon d’incubation utilisé est le suivant : tampon KH2PO4/K2HPO4 10 mM pH=7,5 ; KCl 15 mM. Dans certaines expériences, la solution de thrombine

commerciale est purifiée au préalable à l’aide d’une colonne d’exclusion stérique G10 présentant un cut-off de 5,5 kDa.

- Etape d’incubation pour le système « SSB + aptamère 49-mer »

L’aptamère 49-mer, à une concentration de 6,2 µM est incubé avec 3,44 µM de protéine Single-Stranded Binding, à 37°C pendant au moins 15 min. Le tampon d’incubation utilisé est le suivant : tampon KH2PO4/K2HPO4 10mM pH=7,5 ; KCl 15 mM. La solution de SSB commerciale est également purifiée

pour certaines expériences à l’aide d’une colonne d’exclusion stérique G10 présentant un cut-off de 5,5 kDa.

- Photosensibilisation

De la riboflavine (en solution dans le tampon d’incubation) est ajoutée pour obtenir une concentration finale de 40 µM. L’irradiation est effectuée dans un volume total de 40 µL, pendant 10 ou 20 min avec un lampe halogène, selon le même protocole que celui utilisé dans le paragraphe 8.1.3.

- Irradiation laser

L’irradiation laser est effectuée sur un volume total de 25 µL par échantillon, dans des eppendorf de 100 µL. Le dispositif d’irradiation utilisé est décrit dans le paragraphe 3.3. Chaque eppendorf est ouvert et placé horizontalement dans l’axe du faisceau. On délivre une impulsion laser à 110 mJ par échantillon (ce qui représente une énergie d’environ 1000 mJ/cm2_).

- Détection des pontages par HPLC-MS/MS

Les échantillons sont hydrolysés en conditions acides (cf paragraphe 3.6.) puis les adduits 8-lys-Gua sont dosés par HPLC-MS/MS (cf paragraphe 2.3.).