28 III.2.2 Les systèmes d’imagerie dédiés à la détection de fluorescence
III. Modèles Animaux
II.2 Microscopie Electronique à balayage.
Pour atteindre des résolutions plus importantes, un certain nombre d’empreintes sur puces de silicium ont été préparées pour une observation en MEB. Les échantillons sont fixés en PAF4%. Ils sont déshydratés par des bains d’éthanol de 10 minutes à concentration croissante comme suit : EtOH 70% / 80% / 90% / 100%.
Le dernier bain est fait dans une solution de bis(trimethylsilyl)amine ou hexamethyldisilazane (HMDS, Sigma Aldrich). Les puces silicium sont ensuite placées une nuit en cloche sous vide pour garantir une déshydratation complète. Un dépôt Au/Pd de 200nm d’épaisseur est réalisé pour limiter les effets de charge avant l’observation qui est réalisée sur un système ULTRA55 (Zeiss).
III. Modèles Animaux.
Toutes les procédures d’expérimentation animale conduites au cours de cette thèse ont été réalisées dans le respect de la directive européenne 2010/63/EU de 2013. Les demandes d’autorisation de projet ont été soumises au ministère de la recherche et de l’enseignement supérieur et ont reçu l’approbation du comité local d’Ethique en expérimentation animale.
III.1 Implantation stéréotaxique de cellules tumorales chez le rat.
Le modèle de tumeur F98 implanté chez le rat Fischer 344 (Charles River Laboratories, France) a été retenu car il présente des avantages certains. Ce modèle est syngénique, reproductible, bien caractérisé dans la littérature 131 et reproduit assez bien l’évolution rapide du glioblastome multiforme.
Le jour de la chirurgie, les cellules de la lignée F98 sont préparées en suspension concentrée à 2.106 cellules.mL-1 dans du milieu DMEM. Les animaux sont anesthésiés par
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inhalation d’isoflurane (Vetflurane, Virbac) dans un mélange 60% air 40% O2 (5% isoflurane
pour l’induction de l’anesthésie générale, 2% pour le maintien).
L’animal est placé dans un cadre de stéréotaxie (Kopf) où la tête est fermement maintenue par les barres d’oreilles et la barre de gueule. Le crâne de l’animal est rasé et désinfecté par une solution de Vétédine (Vetoquinol). Après incision médiane du scalp et résection des plans sous cutanés, les sutures osseuses sont révélées par application d’une solution d’eau oxygénée 10%. Les coordonnées stéréotaxiques sont relevées et calculées par rapport à Bregma.
Pour une implantation de tumeur centrée dans le striatum les coordonnées choisies sont Bregma AP 0,2mm Lat. 3,5mm, Profondeur 5mm. L’injection de 104 cellules dans 5µL est faite à la seringue Hamilton 26Ga à raison d’1µL.min-1 . La seringue est rétractée 5min après la fin de l’injection pour limiter au maximum tout reflux de liquide. La plaie est suturée au fil Vicryl résorbable, désinfectée à la Vétédine et l’animal placé en réveil sous lampe chauffante dans une pièce dédiée.
La croissance tumorale est évaluée par suivi longitudinal en imagerie par résonance magnétique. Environ 15 jours après implantation les animaux portent des tumeurs ayant complètement envahi le striatum.
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Figure 11: Illustration de la croissance tumorale suivie en IRM dans un modèle de glioblastome orthotopique syngénique chez le rat.
III.2 Xenogreffe ectopique de cellules tumorales chez la souris.
Le modèle retenu est l’injection sous cutanée de 106 cellules de la lignée U87 chez la souris immuodéficiente HSD :Athymic Foxn1nu/nu (Harlan Laboratories, France). Les animaux sont anesthésiés par inhalation d'IsoFlurane (5% pour l'induction, 2% pour le
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maintien). Les cellules sont injectées dans 200µL de DMEM, sur le flanc, en position sous cutanée. Après 10 minutes de maintien, les souris sont réveillées et remises en stabulation. La croissance tumorale est suivie par mesure de diamètre au pied à coulisse.
III.3 Chirurgie stéréotaxique chez le primate non humain.
Des macaques cynomolgus (Macaca fasicularis, SILABE, France) ont été utilisés pour ce travail. Les animaux sont hébergés en animalerie à statut sanitaire conventionnel. Ils sont soumis à un rythme d’alternance jour nuit 12h/12h et ont accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
a) Prélèvements de fluides biologiques avant et après chirurgie.
L’animal est immobilisé dans sa cage par traction du double fond et anesthésié par injection intra-musculaire de Kétamine Xylazine (10mg.Kg-1 1mg.Kg-1, Imalgen, CentraVet). Après tonte et désinfection, une prise de sang est effectuée en veine saphène pour préparer sérum et plasma. L’animal est ensuite installé pour la réalisation d’une ponction lombaire sous contrôle radiographique.
b) Analyse comportementale.
L’absence de lésions motrices induites par la chirurgie a été évaluée en quantifiant les mouvements de l’animal dans une cage sur des sessions de 30 minutes. Les enregistrements ont été effectués toujours aux mêmes heures et jours de semaine. La quantification a été effectuée grâce au logiciel de video tracking Noldus EthoVision. Deux paramètres ont été retenus, la vitesse moyenne du mouvement et la distance totale parcourue sur l’ensemble d’une session.
c) Procédure chirurgicale.
L’animal est mis à jeun la veille de la chirurgie. Il est anesthésié par injection intamusculaire de Kétamine Xylazine (10mg.Kg-1 1mg.Kg-1, Imalgen, CentraVet). L’animal est installé sur un système homéothermique et placé sous monitoring cardiorespiratoire. Une
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antibiothéarpie prohylactique est pratiquée par administration intraveineuse d’Augmentin 20mg. Kg-1. La tête de l’animal est immobilisée dans un cadre stéréotaxique (David Kopf Instruments). Le repérage anatomique est effectué en réalisant en ventriculographie par injection d’un agent de contraste dans la corne antérieure du ventricule latéral. Les positions des commissures antérieure (AC) et postérieure (PC) sont identifiées par des radiographies de face et de profil. Les coordonnées définitives de descente de l’outil d’empreinte sont calculées par fusion des données de l’atlas stéréotaxique du Macaca fascicularis (BrainInfo, University of Washington, http://braininfo.rprc.washington.edu), de la ventriculographie et des radios et IRM préopératoires.
d) Recueil des empreintes tissulaires sur silicium.
Les puces de silicium utilisées pour la réalisation des empreintes tissulaires sont immédiatement recueillies et plongées dans un tampon de stabilisation adéquat.
Pour l’analyse transcriptomique, les puces silicium sont immergées dans 800µL de tampon de lyse du kit d’extraction d’ARN MirVana (Life Technologies) et congelées immédiatement à - 80°C. Pour l’immunocytochimie, elles sont placées en PAF 4% pendant 30 min et congelées.