2.1.
La lignée cellulaire LS174T répond bien aux inhibiteurs de la γ-sécrétase et de MEK et
l’inhibition de la voie ERK/MAPK semble avoir un effet activateur sur la voie Notch.
Afin de valider la capacité des inhibiteurs sélectionnés (DBZ et CI-1040) à bien inhiber leur cible dans notre modèle cellulaire, des immunobuvardages et des analyses de PCR quantitative en temps réel ont été réalisés. Ces inhibiteurs permettent l’inhibition de la γ-sécrétase et de MEK, respectivement. Les analyses ont été faites sur des lysats de cellules LS174T traitées pendant 96h avec du DMSO (contrôle), le DBZ et le CI-1040. D’abord, en immunobuvardage, HES1 et pERK ont été analysés, pour vérifier l’inhibition respective de la voie Notch et ERK/MAPK (Figure 16A et B). Pour ce qui est de HES1, la condition traitée au DBZ montre une forte perte d’expression, ce qui témoigne d’une inhibition complète de l’activation de la voie Notch, donc d’un bon fonctionnement de l’inhibiteur. Dans le cas de pERK, la condition traitée avec le CI-1040, l’inhibiteur de MEK, montre une diminution de phosphorylation, ce qui était attendu, sans avoir d’effet sur la forme totale de ERK (résultat non montré). Pour bien confirmer l’inhibition de la voie Notch par le DBZ, une analyse de PCR quantitative en temps réel a été faite pour le gène HES1. Comme le montre la figure 16C, l’expression de HES1 est fortement diminuée lorsque les cellules sont traitées avec le DBZ.En plus d’avoir permis de vérifier l’action des inhibiteurs, les immunobuvardages ont permis de voir que l’inhibition de la voie ERK/MAPK, par le CI-1040, semble avoir un effet activateur sur la voie Notch. Comme le montre la figure 16A, pour la condition traitée avec le CI-1040, l’expression de HES1 est plus forte que pour la condition contrôle, ce qui témoigne d’une activation plus importante de la voie Notch lors d’une inhibition de la voie ERK/MAPK. Ce résultat a été confirmé en PCR quantitative en temps réel, où, encore une fois, l’expression de HES1 est significativement plus élevée dans la condition traitée avec le CI-1040 que dans la condition contrôle. Ces résultats ont permis de mettre en lumière un potentiel rôle inhibiteur de la voie ERK/MAPK sur la voie Notch.
2.2.
L’inhibition des voies Notch et ERK/MAPK dans les cellules LS174T module l’expression
des gènes associés aux cellules de la lignée sécrétrice de l’épithélium intestinal
Comme les cellules LS174T ont la capacité de se différencier en cellules caliciformes, elles ont été utilisées afin de vérifier l’expression des différents gènes associés aux cellules caliciformes, suite à l’inhibition de la voie ERK/MAPK. Des analyses de PCR quantitative en temps réel ont été faites pour les gènes MUC2, TFF3 et KLF4. Comme le montre la figure 17, l’inhibition de la voie Notch par le DBZ amène une augmentation de l’expression de ces trois gènes. En ce qui concerne l’inhibition
Figure 16: Validation de l’effet des inhibiteurs dans les cellules LS174T.
Lysats cellulaires de LS174T traitées pendant 96h avec un inhibiteur de la γ-sécrétase (DBZ, 1µM) et un inhibiteur de MEK (CI-1040, 2 µM). A. Immunobuvardages de lysats de HES1, pour évaluer l’activité de la voie Notch. B. Immunobuvardages de ERK phosphorylé (pERK) pour évaluer l’activité de la voie ERK/MAPK. L’actine sert de contrôle de dépôt. C. Analyse par PCR quantitative en temps réel réalisée sur des lysats cellulaires de LS174T traitées pendant 96h avec DBZ ou CI-1040 pour l’expression de HES1. L’expression relative de ce gène a été normalisée sur les gènes de références
de la voie ERK/MAPK, l’effet inverse est observé, alors que MUC2 et TFF3 montrent une diminution d’expression pour la condition traitée au CI-1040, en comparaison avec la condition contrôle. L’effet inhibiteur de la voie ERK/MAPK sur la voie Notch semble donc se transposer sur l’expression des gènes de cellules caliciformes. Par contre, dans le cas de KLF4, qui est un facteur de transcription essentiel à la différenciation terminale des cellules caliciformes (Katz J et al, 2002), l’inhibition de la voie ERK/MAPK n’est pas en mesure de moduler son expression à la baisse. Ces résultats montrent donc un rôle potentiel de la voie ERK/MAPK dans la modulation de la différenciation des cellules caliciformes, en plus de celui déjà connu de la voie Notch.
2.3.
L’inhibition de la voie ERK/MAPK active rapidement la voie Notch
Afin de comprendre comment la voie ERK/MAPK peut moduler la voie Notch, des essais ont été réalisés afin de voir la vitesse à laquelle l’activation de celle-ci a lieu. Des cellules LS174T ont donc été traitées avec le CI-1040 sur de courtes périodes, soit pendant 30 min, 1h, 4h et 24h, le dernier temps servant de contrôle d’activation positif. Comme le montre la figure 18, l’inhibition de la phosphorylation de ERK par le CI-1040 est visible dès 30 min. L’activation de la voie Notch, traduite par une augmentation de l’expression de NIC, semble être plus élevée dès 1h après l’ajout de CI- 1040, avec une augmentation plus visible à 4h. Quant à l’expression de HES1, un gène cible de Notch, celle-ci n’est pas modulée, compte tenu des temps de traitements trop courts. Ces résultats préliminaires montrent donc une capacité de la voie ERK/MAPK à moduler, et ce, de façon assez rapide, le clivage de Notch.
Figure 17: L’inhibition de la voie ERK/MAPK diminue l’expression de la mucine 2 dans les LS174T. Analyses par PCR quantitatives réalisées sur des lysats cellulaires de LS174T traitées pendant 96h avec le DBZ (1µM), pour inhiber la voie Notch, et le CI-1040 (2µM), pour inhiber la voie ERK/MAPK. Les gènes MUC2, TFF3 et KLF4 ont été analysés. L’expression relative de ces gènes a été normalisée sur les gènes de références RPL13A, MRPL19 et PUM1 (* p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, NS : non significatif). N ≥ 5.
Figure 18: Activation rapide de la voie Notch suite à l’inhibition de la voie ERK/MAPK.
Immunobuvardages de pERK, NIC et HES1 sur des lysats cellulaires de LS174T traitées pendant 30 min, 1h, 4h et 24h au DMSO ou au CI-1040 2 µM. L’actine sert de contrôle de dépôt. N=3
DISCUSSION
De par la régulation directe de plusieurs voies de signalisation, SHP-2 est connue pour contrôler plusieurs processus importants dans la cellule. Des travaux précédents dans notre laboratoire ont d’ailleurs montré que la perte d’expression embryonnaire de SHP-2 dans les cellules épithéliales intestinales altérait la différenciation cellulaire dans l’épithélium intestinal après la naissance, perturbant grandement l’homéostasie du côlon (Coulombe et al., 2013 ; Coulombe et al., 2016). Notre nouveau modèle de délétion inductible de l’expression de SHP-2 chez l’adulte a permis de confirmer ce rôle important joué par SHP-2 dans le maintien de l’homéostasie colique et de mieux comprendre les événements de signalisation et cellulaires subséquents à sa délétion. De plus, l’utilisation d’une lignée cellulaire de côlon capable d’exprimer des marqueurs de différenciation typiques des cellules caliciformes a permis de dévoiler certains des mécanismes moléculaires potentiellement impliqués dans la régulation de cette différenciation par SHP-2.