Mise en place de la technique d’Hybridation in situ et son utilisation pour la localisation fine de

la dent

Figure 26 : Représentation schématiques des étapes de l’hybridation in situ

2.3.3.1 Inventaire des besoins et coûts

Tout d’abord afin de mettre en place la technique d’hybridation au sein du laboratoire, j’ai fait l’inventaire des besoins, pris en charge intégralement la commande et la négociation du matériel nécessaire. Ce travail a donc été réalisé de juin à septembre 2013

Cout total TTC non négocié Cout total après remise

12900.21 7190.96 (soit 5709.25 euros de remise =

44.27% de remise totale)

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2.3.3.2 Préparation des sondes

J’ai testé la synthèse de deux types de sondes :

 Par clonage dans un vecteur plasmidique :

Utilisation d’un couple de primers spécifiques de la séquence du gène recherché amplifiée par RT-PCR.

L’amplicon une fois purifié est ensuite cloné dans un vecteur plasmidique nous permettant de répliquer en grande quantité l’insert par transformation dans des bactéries compétentes. Il contient également le gène LacZ alpha permettant la production d’une activité beta galactosidase, qui permet d’identifier les bactéries recombinantes par test « Blanc/bleu ». Le gène de résistance à l’Ampicilline permettra lui d’exercer une pression de sélection et de ne sélectionner que les bactéries ayant intégré le vecteur.

Le plasmide (Fig.27) une fois extrait et purifié est linéarisé par des enzymes de restriction dont les sites se situent à proximité de l’insert de manière à ce que l’ARN polymérase puisse faire la synthèse du transcrit à partir des promoteurs Sp6 (pour site XbaI) ou T7 (pour le site HindII).

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 Par amplification par PCR de l’ADNc : Utilisation de primers spécifiques de la séquence du gène recherché auxquels j’ajoute à chaque extrémité les séquences du promoteur (Tableau 6) Sp6 pour le primer Forward afin de générer la sonde sens 5’ → 3’.

T7 pour le primer Forward afin de générer la sonde antisens 3’ → 5’.

Extraction des ARN totaux et synthèse d’ADNc du rein, de l’os et le germe de molaire de souris sauvage ont été disséqués et les ARN totaux extraits en utilisant le Kit « RNeasy Plus mini kit mini kit » selon les instructions du fabricant pour une extraction à partir de tissu.

Amplification des gènes et séquençage : Les ADNc ont été fabriqués à l’aide du Kit « Verso » à partir de 500ng d’ARN.

Des séquences de 400 et 800pb (taille optimale pour une sonde ARN en Hybridation in situ (Acloque et al., 2008)ont été amplifié par RT- PCR.

L’ADNc de chaque extraction (10ng) a été amplifié par PCR dans un mélange composé de 2.5µl de tampon (10X), 2µl de dNTP (2.5mM chacun), en présence des amorces sens et antisens (1µl de chaque à 10pmol/µl) et de 0,125µl de TAKARA DNA Polymerase. L’amplification s’est déroulée dans un thermocycleur Verity.

Après optimisation des conditions PCR pour l’amplification pour chaque gène, les produits de PCR ainsi obtenus sont déposés sur gel agarose/TBE à 1,5% puis purifiés en utilisant le Kit « NucleoSpin Gel and PCR product Clean Up », et élués dans 15µl de la solution NE (Tampon d’élution).

Les produits de PCR purifiés sont dosés au Nanodrop puis soit réamplifiés par PCR quand utilisation des primers contenant les promoteurs Sp6 et T7, soit transformés (pour les gènes ne possédant pas les promoteurs SP6 et T7 dans les primers utilisés pour l’amplification).

52 Nom gene N° Sequence

reference NCBI

Expression Primer Forward Primer Reverse Taille

amplicon

Col1a1 NM_007742.3 Os Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur Sp6

5’ATTTAGGTGACACTATAGCCC

GAGGTATGCTTGATCTG3’

Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur T7

5’TAATACGACTCACTATAGGGCC

TTGGAAACCTTGTGGACC3’

480pb

Claudin-16 NM_053241.5 Rein N°1 : Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur Sp6

5’ATTTAGGTGACACTATAGGGT

AACTCGAGCACTGATGAT3’

N°2 Sur région 5’UTR de Cld 16 : Design primers avec promoteurs Sp6

5’ATTTAGGTGACACTATAGAG

GGATGTGAGGAAACGTGAAA3’

N°1 Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur T7

5’T7TAATACGACTCACTATAGGG

ACCTGCAGTTGAATAGGGCT3’

N°2 Sur région 5’UTR de Cld16 : Design primers avec promoteurs T7

5’TAATACGACTCACTATAGGGTC

ATCAGTGCTCGAGTTACCAC 3’

594pb

440pb

Claudin-3 NM_009902.4 Rein Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur Sp6

5’ATTTAGGTGACACTATAGAA

ATGTACGACTCGCTGCTG3’

Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur T7 TAATACGACTCACTATAGGGGAC CAGGACACCGGTACTAA3’ 250pb Enam NM_017468.3 Germe de molaire souris

Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur Sp6

5’ATTTAGGTGACACTATAGATG

TGGCCTGGTACCAAATG3’

Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur T7 5’TAATACGACTCACTATAGGGCA TGGTGGTTGTGGATAGGG3’ 530pb Amelx NM_009666.4 Germe de molaire souris

Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur Sp6

5’ATTTAGGTGACACTATAGGCA

ACCAATGATGCCAGTTC3’

Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur T7

5’TAATACGACTCACTATAGGGAG

AGGCAGCTCAGGAAGAAT 3’

287pb

Npt2A NM_011392.2 Rein Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur Sp6

5’ATTTAGGTGACACTATAGTGA

CCCGAGGGTATAAAGAAGA3’

Primers pour amplification du cDNA par PCR avec primers contenant le promoteur T7

5‘TAATACGACTCACTATAGTTGG

TGACAGAGGTTCC3’

720pb

53 Synthèse des sondes ARN :

Les sondes ARN antisens marquées à la Digoxigenin-UTP, sont synthétisées par SP6 à l’aide du Kit « Riboprobe® Combination System—SP6/T7 RNA Polymerase » en suivant les instructions du fabricant, avec le mélange de nucléotides suivants : 1µl de rATP, 1µl de rCTP, 1µl de rGTP, 0,5µl de rUTP, et 0,5µl de digUTP. Les sondes sont purifiées à l’aide du Kit « illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns ».

Afin de vérifier la présence et la taille de la sonde synthétisée en ARN je procède à un dépôt sur gel d’agarose 1.5%.

2.3.3.3 Préparation des coupes de tissus

Les échantillons de reins sont fixés avec du paraformaldéhyde 4% injecté en intracardiaque avant inclusion en OCT afin de conserver au maximum l’intégrité du tissu et éviter tout nécrose. Les mandibules de souris C57 WT J3 post natal sont incluses directement en OCT après prélèvement (elles seront fixées dans du PFA 4% uniquement après décongélation). Les pièces ont été coupées à l’aide d’un cryostat et déposées sur des lames Superfrost plus.

2.3.3.4 Hybridation in situ (HIS)

Les coupes sont décongelées 15 minutes à température ambiante puis fixées au PFA4% durant 10 minutes à température ambiante.

Les coupes sont rincées avec du PBS et de la protéinase K (20mg/ml, Invitrogen) est ajoutée à une concentration de 0,5µg/ml, dans du PBS 0,1M (PH 7.4) à 37°C pendant 6 minutes. Les coupes sont rincées avec du PBS puis fixées pendant 30 min dans du paraformaldéhyde à 4%. Après deux bains successifs de PBS et de SSC 2X, la sonde est hybridée dans une chambre humidifiée au SSC 2X à 65°C pendant une nuit. Les lames sont rincées dans un tampon avec du formamide 50% à 65°C, 30 min, puis 2 fois 1h. Après 2h de blocage dans une solution de sérum de chèvre inactivé à 20% et de Blocking Reagent 2%, l’antiDig, ajoutée à cette solution, est déposée sur les lames, durant la nuit, à température ambiante. Après rinçage, la révélation est réalisée :

Soit au BCIP (5- Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate-4-toluidine salt à 3,5µl/ml) combiné au NBT (Nitro Blue Tetrazolium Chloride à 0,45µl/ml, Roche) substrats de la phosphatase alkaline catalysant une réaction colorée (apparition d’un précipité bleu) observable en lumière blanche.

Soit au en utilisant le kit détection HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic-2’-phenylanilide phosphate) / Fast Red TR (4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt) substrat fluorescent pour la phosphatase alkaline qui permet une détection en théorie plus sensible qu’en

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lumière blanche. L’absorbance max du HNP/Fast Red TR est 553nm pour une émission max de 584nm (565-620nm).

Les lames sont rincées et recouvertes d’une lamelle montée en Gel Mounting Medium pour la lumière blanche, soit en Mowiol ^® 4-88 Reagent. L’acquisition d’images est réalisée à l’aide d’un microscope Leica DFC 425.