Esta técnica é a mais recente e complexa, em relação às anteriormente descritas (IIU e FIV). Para este procedimento é necessário equipamento especializado para micromanipulação a 3D, que consiste (Barnes, 2009):
Microscópio invertido com ampliação e contraste adequados à realização da técnica (figura 22);
Micropipetas de vidro que permitam o manuseamento dos gâmetas (figura 23);
Micromanipuladores com um sistema hidráulico, permitindo um movimento suave (figura 24).
Figura 22 ‒ Microscópio invertido para micromanipulação de gâmetas e embriões. Este equipamento é propriedade do CEIE e foi reproduzido com permissão.
Figura 23 – Micropipetas de vidro montadas no microscópio invertido. Estas são utilizadas na micromanipulação de gâmetas e embriões. Este equipamento é propriedade do CEIE e foi reproduzido com permissão.
Figura 24 – Micromanipuladores do microscópio invertido, através dos quais é possível movimentar as micropipetas e aspirar ou rejeitar meio de cultura. Este equipamento é propriedade do CEIE e foi reproduzido com permissão.
É também essencial um estereomicroscópico (figura 25), para manusear os gâmetas entre placas, e um ambiente favorável à micromanipulação, com temperatura e atmosfera controladas (figura 26), uma vez que os ovócitos são células muito sensíveis a diferenças de temperatura devido ao facto de se encontrarem em plena meiose (parados em metafase II) (Barnes, 2009).
Figura 25 – Estereomicroscópio. Este equipamento é propriedade do CEIE e foi reproduzido com permissão.
Figura 26 – Bancada aquecida (zona mais clara) junto ao estereomicroscópio, com controlo da atmosfera (comandos de controlo da temperatura, luz e ventilação no plano mais próximo da imagem). Este equipamento é propriedade do CEIE e foi reproduzido com permissão.
A ICSI é aconselhada na presença de fator masculino grave, após obtenção de espermatozoides de TESE, depois de falhas de fecundação em FIV, para realização posterior de diagnóstico genético pré-implantação (DGPI), para inseminação de
ovócitos criopreservados, entre outras indicações (Zulategui et al., 2008). Como acontece numa FIV, é realizada a indução da poliovulação e a punção folicular. A amostra de sémen é recolhida no dia da punção e tratada no laboratório. No caso de ser necessário descongelar os gâmetas masculinos, o procedimento é também realizado no dia da punção folicular.
Previamente à realização da ICSI propriamente dita, os ovócitos são desnudados, ou seja, são desagregados das células do cumulus e da corona, após um período de pré- incubação (que se pensa levar a um aumento da taxa de fertilização (Dozortsev et al., 2004)). Este procedimento facilita a avaliação da maturação ovocitária (apenas os ovócitos que se encontram em MII (apresentam um GP) serão inseminados) e também o manuseamento dos gâmetas durante a micromanipulação (Gómez et al., 2008). A desnudação é realizada com recurso a um método misto, sendo primeiramente enzimático e depois mecânico (Gómez et al., 2008). Os CCCO são incubados durantes alguns segundos numa solução que contém a enzima hialuronidase (Hyase™,Vitrolife, Suécia). Esta vai enfraquecer as ligações intercelulares da corona e do cumulus, facilitando a sua remoção (Taylor et al., 2006). Após este passo, os CCCO são lavados em meio de cultura, realizando-se sucessivas pipetagens para que ocorra remoção mecânica das células do cumulus e da corona. Após este processo, os ovócitos são avaliados com precisão quanto à sua maturação (VG, MI ou MII) e posteriormente mantidos em cultura (37°C, 5% O2, 6% CO2 e saturação de humidade)
até à execução da ICSI.
O desempenho laboratorial da ICSI envolve a escolha dos melhores espermatozoides (figura 27), o esmagamento da sua cauda (figura 28) e posterior introdução (através da pipeta ICSI) direta no citoplasma do ovócito (que está a ser segurado pela pipeta holding) (figura 29 e figura 30). Um único espermatozoide é introduzido num único ovócito.
Figura 27 ‒ Espermatozoides móveis no meio ICSI™ (Vitrolife, Suécia; meio viscoso que não permite uma motilidade tão acelerada) a serem selecionados morfologicamente e aspirados para a pipeta de ICSI.
Figura 28 ‒ Após a seleção dos melhores espermatozoides, é necessário proceder ao esmagamento da cauda (com a pipeta de ICSI), de modo a facilitar a sua manipulação e a descondensação do núcleo e, também, para que não altere a estrutura do ovócito após a introdução no citoplasma (Palermo et al., 1996).
Figura 29 ‒ Microinjeção do ovócito. Este está a ser seguro pela pipeta holding e a pipeta ICSI, com o espermatozoide no seu interior, encontra-se prestes a perfurar o ovócito.
Figura 30 ‒ Microinjeção do ovócito, onde a pipeta de ICSI já está dentro deste. É necessário ocorrer aspiração de algum citoplasma para envolver o espermatozoide e para garantir que a membrana citoplasmática do ovócito foi rompida (Zulategui et al., 2008).
A seleção do espermatozoide a injetar no ovócito baseia-se em duas características muito importantes, a motilidade e a morfologia. Contudo, a ICSI não permite escolher os gâmetas de acordo com a sua funcionalidade, pois espermatozoides morfologicamente normais poderão possuir danos na informação genética (Charehjooy et al., 2014). Tendo em conta que danos na membrana (provocados por agentes tóxicos ou por espécies reativas de oxigénio) também afetam a integridade do ADN (Nasr-Esfahani et al., 2002), Charehjooy et al. (2014) desenvolveram um estudo evidenciando as potencialidades da utilização de um HOS prévio a todas as ICSI como
um método melhorado para a seleção dos gâmetas com maior potencial. Recentemente também surgiu uma técnica melhorada com o nome de injeção intracitoplasmática de espermatozoides em elevada ampliação (IMSI), que permite a seleção das células reprodutoras morfologicamente normais ao nível de alguns organelos (acrossoma, porção pós-acrossoma, peça intermédia, cauda e núcleo) (Bartoov et al., 2002), o que não era possível durante a ICSI. Deste modo, seria possível evitar a microinjeção de espermatozoides com danos, mas aparentemente normais, levando ao aumento das taxas de sucesso. Contudo, a IMSI é bastante demorada (Lo Monte et al., 2013), a temperatura deve ser ajustada consoante a motilidade espermática e só é aplicada a espermatozoides móveis (Bartoov et al., 2002). Segundo Teixeira et al. (2013), o uso clínico da técnica de IMSI ainda não é recomendado, devido à falta de estudos que comprovem o seu contributo para o aumento as taxas de sucesso. Sugerem ainda a realização de mais estudos científicos para se perceber os efeitos da IMSI na taxa de nados vivos, de gravidez clínica, de abortos e de anomalias congénitas.