Microscopie et cytométrie

Le microscope confocale utilisé pour l’ensemble des expériences est un microscope Zeiss LSM 510, objetif 10x, laser argon 488 nm et filtre BP 505-550 nm pour la mesure de l’émission de la GFP, et du TOTO-1 ; et Laser Helium-Neon 543 nm et filtre LP 585 nm pour l’observation du PI. Le cytomètre utilisé pour ces expériences est un cytomètre BD-FacsScan BD bioscience, Laser Argon 488 nm et filtre BP 585±42 nm pour l’observation du PI, et filtre BP 520±42 nm pour la GFP.

B. Formation

Principe de la goutte suspendue (Timmins and Nielsen, 2007) : une boîte 24 puits est préparée, 500 µL d’un mélange agar 4% - milieu de culture (50/50 v/v) sont coulés dans chaque puits, puis recouverts de 500 µL de milieu de culture. 500 cellules sont ensemencées par goutte de 20 µL de milieu de culture sur le couvercle renversé d’une boîte 24 puits (1

179 goutte par puits) (jour 0). Les cellules se regroupant par sédimentation, les contacts cellule/cellule sont favorisés au détriment des contacts cellules/matrice. Au jour 4, les puits sont vidés de leur milieu et les gouttes projetées dans le puits en tapant la boîte à plat sur la paillasse. Les petits sphéroïdes sont recouverts de 500 µL de milieu frais. Pour toutes les expériences, les sphéroïdes sont utilisés au jour 6.

C.Électroperméabilisation

Les impulsions électriques à vagues carrées sont délivrées par un générateur Jouan (St Herblain, France) grâce à des électrodes planes et parallèles en acier inoxydable espacées de 4 mm. Les impulsions sont visualisées à l’aide d’un oscilloscope (Meteix). Pour les impulsions unipolaires, 10 impulsions de 5 ms sont appliquées à une fréquence de 1 Hz. Dans le cas d’impulsions bipolaires, un inverseur de polarité manuel est utilisé. 5 impulsions de 5ms sont délivrées dans une polarité, suivies de 5 dans l’autre, à une fréquence de 1 Hz.

Cellules en suspension : 500000 cellules sont centrifugées à 0.7 rcf (centrifugeuse Centrifuge Eppendorf 5415 D) pendant 3 minutes puis resuspendues dans 100 µL de tampon de pulsation contenant 0,1 mM de PI pour la perméabilisation, ou 1µg de plasmides peGFP- C1 pour la transfection. La suspension est ensuite placée entre des électrodes dans une chambre de pulsation, et le champ électrique est appliqué. Pour la perméabilisation, les cellules sont incubées pendant 5 minutes à température ambiante après l’application du champ électrique puis diluées dans 300 µL de tampon PBS pour déterminer le taux de perméabilisation par cytométrie en flux. Pour la transfection, la suspension est placée dans 1,5 mL de milieu de culture cellulaire dans une boîte de Pétri (Ø 35 mm) à 37°C en présence de 5% CO2 pendant 24 heures avant l’analyse par cytométrie en flux de l’expression de GFP ou l’analyse de la viabilité cellulaire.

Sphéroïdes : le sphéroïde âgé de 6 jours est tout d’abord lavé dans 1 mL de PBS puis placé dans 1 mL de tampon de pulsation. 100 µL de tampon de pulsation contenant 0,1 mM de PI (perméabilisation) ou 10 µg de plasmides peGFP-C1 (transfection) sont placés entre les électrodes. Le sphéroïde est prélevé dans un minimum de tampon et ajouté entre les électrodes dans une chambre de pulsation et les impulsions sont appliquées. Pour l’étude de la perméabilisation, le sphéroïde est incubé pendant 5 minutes à température ambiante avant d’être prélevé et de suivre le protocole de dissociation pour l’analyse par cytométrie en flux ou d’être observé au confocal. Pour l’étude de la transfection le sphéroïde récupéré et remis dans son puits contenant du milieu frais (500 µL) et placé à 37°C en présence de 5% CO2

180

pendant 24 heures avant l’analyse par microscopie confocale ou cytométrie en flux de l’expression de GFP.

D.Analyse quantitative

Les cellules perméables ou transfectées sont comptées par cytométrie en flux. Dissociation des sphéroïdes : 3 sphéroïdes sont incubés dans 100 µL de trypsine 1X pendant 10 minutes (sphéroïdes de 600 µm environ) puis dissociés mécaniquement à la pipette (p200). L'échantillon est repris dans 300 µL de PBS puis placé dans la glace.

E.Interaction ADN/membrane

L’ADN est marqué au TOTO-1 extemporanément avec un ratio TOTO/pb de 1/10. Une fois le TOTO-1 ajouté à l’ADN, le mélange est incubé pendant 1 heure à 4°C dans l’obscurité. L’application des impulsions électriques se fait dans les mêmes conditions que décrites précédemment pour les cellules en suspension comme pour les sphéroïdes en utilisant l’ADN marqué. Tout de suite après l’application des impulsions, les cellules ou le sphéroïde sont récupérés et observés au microscope confocal.

F.Viabilité

Cellules en suspension : la viabilité cellulaire est estimée en mesurant la quantité relative de cellules vivantes 24h après l’application du champ électrique. Les cellules sont lavées 3 fois au PBS afin d’éliminer toutes les cellules mortes. Les cellules vivantes adhérentes sont colorées au cristal violet 0.1% pendant 20 minutes puis lysées à l’acide acétique 10% pendant 10 minutes. Le lysat est dilué au 40ème avant lecture de la densité optique au spectrophotomètre (Pharmacia Biotech, Novaspec) à 595 nm. Le contrôle n’ayant pas subi d’électroperméabilisation sert de référence, on considère que sa valeur de DO correspond à 100 % de viabilité cellulaire la coloration étant directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes.

Sphéroïdes : la viabilité cellulaire suite à l’électrotransfection sur les sphéroïdes est évaluée en mesurant leur capacité à croître. La surface des sphéroïdes est mesurée après prise de vue au microscope classique toutes les 24 heures, grâce à la fonction « analyse particles » appliquée sur la mesure de l’aire (Set measurement : Area) du logiciel imageJ.

Taux de mortalité : le sphéroïde soumis au protocole d’électrotransfection est remis dans son puits à 37°C, 5% CO2 pendant 30 minutes. Il est ensuite placé directement dans 100 µL

181 d’une solution de PI à 0,1 mM pendant 5 minutes, puis récupéré et placé dans une chambre d’observation dans le but d’être observé au microscope confocal.

G.Analyse qualitative

Les sphéroïdes sont placés dans 300 µL de PBS sur un support Lab-Tech ou au sein de CoverWell imaging Chambers (Sigma-Aldrich) afin de pouvoir être visionnés à l’aide d’un microscope confocal. Des prises de vue sont réalisées dans différents plans en z et sur chaque face du sphéroïde. Une seule face est représentée dans les figures.

V.

Chapitre 2 - AFM

A. Appareillage

L’appareil Nanowizard 3 (JPK instrument, Berlin, Germany) a été utilisé pour l’ensemble des expériences. Cet AFM est couplé à un microscope inversé à fluorescence Zeiss AxioVert Observer D1.m, (Carl Zeiss). Une caméra Jenoptik ProfRes MF-Cool (Jenoptik, Jena, Germany). Source fluorescence Kublen HXP 120 C. Les leviers utilisés sont des MLCT (Brucker, Camarillo, CA USA). Le levier C présentant une constante de raideur fabricant de 0,04 N/m est utilisé (entre 0.028 to 0.042 N.m-1 mesurés). Avant de faire des mesures sur échantillon, pour chaque expérience, le levier est calibré selon la méthode du bruit thermique dans du PBS. Les données de calibration (constante de raideur et sensibilité) sont enregistrées et utilisées pour toutes les analyses. Paramètres utilisés pour les images rapides en mode Quantitative Imaging TM : Z-length : 5 µm ; force : 4 nN ; Vitesse : 166 µm/s ou 1000 µm/s. Paramètres utilisés pour les mesures de force en mode Force Volume : Z-length : 5 µm ; force : 4 nN ; Vitesse : 24.98 µm/s.