Ce projet a pour cadre une collaboration entre le CRAN et le Laboratoire Interdisciplinaire des Environnements Continentaux (LIEC, UMR CNRS 7360, Nancy) ayant pour objectif le dé-veloppement d’outils originaux de traitement des images hyperspectrales acquises en microscopie confocale. Ce travail s’inscrit dans le projet ANR HÆSPRI (« Hyperspectral Analysis and
En-hanced Surface Probing of Representative bacteria-mineral Interaction », 2009-2013) porté par
Christian Mustin (LIEC).
Contrairement au projet sur la microscopie AFM qui permet d’imager une bactérie ou une cellule biologique à l’échelle de l’atome, la microscopie confocale fournit des images d’une
popula-tion de cellules pour comprendre les interacpopula-tions des cellules avec leur environnement. L’objectif
est donc de fournir une description statistique du comportement d’une population à l’échelle macroscopique. Les deux points de vue sont complémentaires : l’analyse d’une cellule biologique à l’échelle nanométrique permet de comprendre les mécanismes responsables des processus d’in-fection de la cellule alors que le point de vue macroscopique met en évidence le comportement statistique de différents types de cellules.
(a) (b)
Figure 2 – Microscopie confocale et imagerie hyperspectrale. (a) Schéma de fonctionnement d’un microscope confocal (mesures de fluorescence). (b) Acquisition d’une pile d’images hy-perspectrales f(x, y, λi) dans le même plan focal. Les images sont de taille 512 × 512 pixels et la taille d’un pixel est de 100 × 100 nm2.
Imagerie de bio-capteurs bactériens
Le contexte du projet est l’étude de bio-capteurs bactériens dans les sols. Ce sont des bactéries génétiquement modifiées qui émettent des signaux de fluorescence lorsqu’elles sont excitées par un laser. Ces signaux sont liés à l’interaction de la bactérie avec son environnement : ils diffèrent selon que la bactérie est en contact avec une source de pollution ou non. Leur analyse a pour but de détecter et d’identifier les polluants présents dans les sols.
Pour pouvoir modéliser la réponse fonctionnelle adaptative des bactéries à leur environne-ment minéral, le LIEC possède à la fois des micro-spectromètres performants (spectrofluoro-mètre, microscope confocal) capables d’acquérir des images multivariées ou multimodales (es-pace, longueur d’onde, concentration, température, etc.) résolues à l’échelle d’une cellule, et des outils de microbiologie et de biologie moléculaire permettant de sélectionner des agents microbiens particulièrement actifs des sols et de les modifier génétiquement. Les bio-capteurs environnementaux sont obtenus par insertion de gènes rapporteurs codant des émetteurs lumi-nescents ou fluorescents [LEV 02, LAR 05]. Grâce à ces outils, il est possible d’entreprendre des analyses spectrales de suspensions de bio-capteurs. Ils jouent le rôle de bactéries « rapporteuses » interagissant avec des grains minéraux de petite taille dans des conditions variables. L’émission polychromique de lumière résulte des multiples interactions entre les différentes bactéries et leur milieu environnemental.
Un microscope confocal est un microscope optique qui permet d’acquérir des images de fluorescence g(x, y, λ) à différentes longueurs d’ondes λ. Ces images représentent un ensemble de bactéries génétiquement modifiées (bio-capteurs), illuminé par un rayonnement laser. Le schéma de fonctionnement d’un microscope confocal est illustré sur la figure 2. Une lumière laser monochromatique est envoyée sur l’échantillon en positionnant le plan focal à un certain niveau de profondeur. Pour un niveau de profondeur z donné et en chaque pixel (x, y), l’interaction de la lumière incidente avec l’échantillon produit l’émission d’un signal ou spectre de fluorescence
λ 7→ g(x, y, λ) pour des longueurs d’ondes λ supérieures à la longueur d’onde excitatrice. Le
2. Problèmes inverses et traitement de signaux tridimensionnels
rayons émis. Ce système d’acquisition peut donc produire des images hyperspectrales 3D g(x, y, λ) ou 4D g(x, y, z, λ) en faisant varier la profondeur z du plan focal. Les données peuvent être vues comme une pile d’images (cf. fig. 2(b)) ou comme un ensemble de spectres 1D λ 7→ g(x, y, λ) pour un grand nombre de positions spatiales (x, y) ou (x, y, z).
Séparation et restauration d’images hyperspectrales
Déconvolution d’images. Lors de l’acquisition, les images présentent des dégradations (con-volution ou flou) dues à l’appareil de mesure [BIG 04, PAN 09]. La décon(con-volution consiste à enle-ver le flou pour restaurer des images nettes à chacune des longueurs d’ondes [SAR 06, DUP 09]. Les données g(x, y, λ) sont modélisées par :
g(x, y, λ) = h(x, y; λ) ∗
(x,y)f (x, y, λ), (1) où h est la réponse impulsionnelle du microscope et pour chaque longueur d’onde λ, f(x, y, λ) désigne l’image nette inconnue.
Au lieu de restaurer séparément chacune des images hyperspectrales f(x, y, λ), nous avons proposé dans la thèse de Simon Henrot de traiter ces problèmes de façon conjointe (quelquesoit
λ) [R4, C2] en imposant d’une part la positivité de l’image f et d’autre part une régularisation
inter-images, i.e., l’image restaurée à une longueur d’onde λ prend en compte l’image g(x, y, λ) mais aussi les données aux longueurs d’ondes adjacentes g(x, y, λ ± δλ). Nous avons proposé un algorithme rapide adapté aux images hyperspectrales de grandes dimensions en imposant une régularisation de Tikhonov [R4]. Puis, nous avons étendu cet algorithme à une régularisation préservant les contours spatiaux dans l’image f(x, y, λ) [C2]. Ces algorithmes sont basés sur des transformées de Fourier 2D (transformée de Fourier de chaque image spatiale g(x, y, λ) pour λ fixé) et des calculs rapides dans le domaine de Fourier spatial.
Séparation de sources. Pour comprendre l’interaction de micro-organismes dans un mi-lieu naturel particulier (par exemple, l’exposition de bactéries à un métal toxique), nous avons proposé d’analyser les images hyperspectrales par une procédure de séparation de sources. Un mélange correspond à un pixel, et le nombre de mélanges peut typiquement atteindre 5122. Pour un ensemble de bactéries génétiquement modifiées, un signal source décrit soit la fluorescence d’une bactérie non modifiée génétiquement, soit celle de l’un des gènes ajoutés. En un pixel (x, y), le signal de fluorescence λ 7→ f(x, y, λ) s’exprime comme le mélange bilinéaire de signaux sources sk(λ) : f (x, y, λ) = p X k=1 ak(x, y)sk(λ), (2)
où ak(x, y) représente le poids de la k-ème source à l’intérieur du pixel et p désigne le nombre de sources présentes. Les poids ak(x, y) et les signaux sources sk(λ) sont tous à valeurs positives ou nulles.
La spécificité du problème de séparation de sources est liée au très grand nombre de mélanges. Pour pouvoir appliquer les algorithmes de séparation de sources positives en un temps de calcul raisonnable, il faut procéder à une réduction de dimensionnalité, par exemple par une procédure de sélection de pixels. Nous avons proposé une solution [C10] qui couple une procédure de sélection de mélanges et l’utilisation de l’algorithme Bayesian Positive Source Separation conçu au CRAN [MOU 06].
Déconvolution d’images et séparation de sources
Dans thèse de Simon Henrot, nous avons abordé la séparation aveugle de sources en considé-rant l’influence d’une étape préliminaire de déconvolution sur les résultats de séparation. Nous nous sommes intéressés aux conditions d’identifiabilité des signaux sources qui reposent sur le modèle géométrique de simplexe de volume minimal. Pour le modèle de mélange positif de sources (2) sans effet convolutif, la condition (suffisante) classique de « pixels purs » [BIO 12] stipule que chaque source doit être observable à l’état pur dans l’un des mélanges (f(x, y, λ) =
ak(x, y)sk(λ)) pour garantir l’identifiabilité. Géométriquement, chaque sommet du simplexe de volume minimal est atteint. Cette condition très restrictive peut néanmoins être relaxée en une condition portant la présence de mélanges de sources, situés sur les facettes du simplexe [RT1]. Pour des données convoluées g(x, y, λ) générées par les modèles (1) et (2), l’analyse du problème d’identifiabilité montre que la convolution (1) par une réponse impulsionnelle h(x, y; λ) à valeurs positives induit une contraction des points (mélanges de sources) à l’intérieur du simplexe de volume minimal. En d’autres termes, le caractère mal posé du problème de séparation de sources à partir des données brutes g(x, y, λ) est accru. Pratiquer une déconvolution des images g(x, y, λ) en amont de la séparation de sources est donc très pertinent [RT1]. Ces résultats théoriques ont été validés par le traitement de données réelles en microscopie Raman, fournies par Manuel Dossot (LCPME).
Ces travaux ouvrent la voie au développement de méthodes conjointes de déconvolution et de séparation de sources. Le défaut d’une approche en deux temps (déconvolution puis séparation) est d’une part une propagation d’erreurs : des résultats de déconvolution imparfaits sont utilisés en entrée de la procédure de séparation. D’autre part, lorsqu’on régularise le problème de dé-convolution (1), on impose des contraintes sur les images f(x, y, λ) liées au mélange de sources alors qu’en réalité, les images que l’on souhaite estimer sont les images ak(x, y). Pour toutes ces raisons, notre projet est de concevoir un algorithme qui réalise simultanément la restauration des images hyperspectrales et la séparation de sources positives. La difficulté de ce problème vient du fait que la réponse impulsionnelle h(x, y; λ) dépend des dimensions spatiales x et y, mais aussi de la longueur d’onde λ à laquelle l’image est acquise. En intégrant les modèles (1) et (2), on s’aperçoit que les données convoluées
g(x, y, λ) = X k h(x, y; λ) ∗ (x,y)ak(x, y) sk(λ) (3)
ne s’expriment pas comme un mélange bilinéaire des sources sk, car le terme h(x, y; λ) ∗
(x,y)ak(x, y) dépend de λ. L’hypothèse de mélange instantané de signaux sources n’est donc plus valable.
Références associées : [R4, C2, C3, C10, CN2, CN3, COM3, COM4, RT1].