MATERIEL & METHODES
D. Microscopie électronique à transmission
Toutes les solutions (sauf les anticorps et les fixateurs) utilisées en microscopie électronique sont filtrées sur des tamis de 0,22 µm pour éliminer toutes les poussières, amas ou micro-organismes éventuels qui pourraient gêner l’observation.
1. Microscopie classique
a. Préparation de grilles pour l’ultramicrotomie
Les grilles 100 mesh CP (mesh: nombre de barreaux/grille, plus il y a de barreaux plus les carrés sont petits, CP: cuivre sur une face, palladium sur l’autre) sont lavées avec 25 ml d’éthanol pur dans un tube Falcon puis mises à sécher à l’étuve à 60°C sur du papier Watman. Vingt grilles sont ensuite déposées sur un film de Formvar flottant à la surface d’un ménisque d’eau distillée dans un cristallisoir.
Le film de Formvar est réalisé en lâchant une lame de verre dans un récipient contenant le Formvar et en la retirant lentement et régulièrement. Les trois arêtes de la lame sont grattées avec une lame de rasoir et les deux coins inférieurs sont coupés pour permettre au film de formavar de se désolidariser de la lame de verre en la plongeant dans l’eau avec un angle de 45°.
Les grilles sont récupérées en plongeant verticalement, sur le film de Formvar, une lame de verre recouverte d’une étiquette blanche (type étiquette de bureau). Le Formvar vient se coller sur la lame. Les grilles recouvertes de Formvar sont ensuite carbonées.
b. Coloration des compartiments en communication avec le milieu extracellulaire
La coloration a été adaptée à partir du protocole décrit par Galbiati et al. (2001). La souris est anesthésiée au pentobarbital et perfusée avec un fixateur (2% PFA, 0,2% Glutaraldéhyde, tampon phosphate 0,1 M), les muscles prélevés sont dilacérés en petits paquets de fibres. Après trois rinçages en tampon cacodylate, les fibres sont post-fixées en 2,5% glutaraldéhyde, 75 mM CaCl2, tampon cacodylate 0,1 M, 2 h à 4°C. Le fixateur est rincé trois fois en tampon cacodylate puis les tubules transverses sont colorés avec 1% OsO4, 0,4% K3Fe(CN)6 2 h, à l’obscurité. L’excès est rincé une fois en tampon cacodylate puis quatre fois par de l’eau et le contraste est amélioré par une coloration à l’acétate d’uranyl 4% pH = 4 (2 h sur glace à l’obscurité). Les fibres sont ensuite incluses en résine Epon.
c. Immunomarquage à l’or en préinclusion
Les muscles sont prélevés sur une souris anesthésiée au pentobarbital et perfusée en intracardiaque avec du fixateur comme décrit dans le paragraphe précédent. Les muscles sont ensuite dilacérés pour obtenir des paquets d’une à trois fibres. La PFA est inactivée par de la glycine 50 mM diluée dans du PBS pendant 15 min. Les membranes sont ensuite perméabilisées pendant 30 min dans le tampon A (50 mM glycine, 0,5% BSA, 0,05% azide, 0,03% saponine, dans du PBS) et les fibres sont incubées avec l’anticorps primaire dilué dans ce même tampon à 4°C sur la nuit. Après trois lavages de 30 min dans le tampon A, les fibres sont incubées avec l’anticorps secondaire qui est un fragment Fab’ anti-espèce couplé à des nano-particules d’or de taille suffisamment petite pour permettre leur pénétration à travers la membrane perméabilisée (Nanogold® Gold-Antibody Conjugates, Nanoprobes). L’excédent et les particules fixées de façon non spécifiques sont éliminés par trois lavages dans le tampon A pendant 1 h. Les fibres sont rincées au PBS et le marquage est fixé en glutaraldéhyde 2% tampon phosphate 0,1 M pH = 7,2 durant 1 h. Après plusieurs lavages à l’eau, la taille des nano-particules d’or est augmentée par enrobage de couche d’argent pour permettre leur observation (HQ SilverTM enhancement kit, Nanoprobes). Les fibres sont de nouveau rincées à l’eau puis stockées pour la nuit dans du tampon phosphate à 4°C. Les fibres sont colorées le lendemain à l’obscurité 20 min sur glace avec du tetroxyde d’osmium 0,5% dilué dans du tampon phosphate. Après quatre lavages à l’eau les fibres sont colorées à l’acétate d’uranyl 1% pH = 4, dilué dans l’eau, à l’obscurité 15 à 20 min. Comme pour l’inclusion simple des tissus, les fibres sont ensuite déshydratées et incluses dans la résine puis coupées à l’ultramicrotome.
d. Inclusion des tissus en résine
L’inclusion des muscles en résine épon peut être précédée d’un immunomarquage à l’or en préinclusion ou d’une coloration des compartiments en communication avec le milieu extracellulaire. Les muscles sont prélevés après perfusion intracardiaque de fixateur (2% PFA,
sont post-fixés et colorés au tetroxyde d’osmium (1% OsO4, tampon cacodylate 0,1 M) 1 h sur glace. L’excès d’osmium est lavé dans du tampon cacodylate puis dans de l’eau et le tissu est coloré à l’acétate d’uranyl 1% pH = 4 sur la nuit à 4°C. Les muscles sont déshydratés par des bains d’alcool successifs de concentrations croissantes (30%, 60%, 90%, 3 x 100%). L’éthanol est ensuite substitué dans le muscle par de la résine epon par une incubation dans un mélange 50% ethanol -50% résine Epon. Le tissu est ensuite incubé et inclus en résine Epon pure. La polymérisation de la résine est réalisée pendant trois jours à 60°C.
e. Coupe et coloration
Les blocs de résine sont coupés en tranches ultrafines de 70 nm d’épaisseur à l’utramicrotome. Une seconde étape de coloration à la suite de la coupe permet d’augmenter les contrastes. Les sections sont incubées dans de l’acétate d’uranyl 5% pH = 4 pendant 10 min à l’obscurité puis rincées à l’eau avant d’être réincubées dans du citrate de plomb 4%, NaOH 10 mM, 5 min à l’obscurité. Le citrate de plomb est rincé à l’eau.
2. Cryométhode
a. Congélation des tissus
Les souris sont anesthésiées et perfusées à la PFA 2%, glutaraldéhyde 0,2%, dans du tampon phosphate 0,1 M. Les muscles sont prélevés, découpés en petits morceaux d’1 mm3 et incubés dans du cryoprotecteur (2,3 M sucrose, 0,1 M tampon phosphate) pendant une nuit à 4°C sous agitation. Les muscles sont ensuite montés sur des clous de microscopie électronique en enlevant le maximum de sucrose avec du papier filtre. Le bloc clou-échantillon est congelé dans l’azote liquide en agitant pendant 15 s pour éviter la formation de cristaux.
b. Coupe des tissus congelés à l’ultramicrotome
La chambre de coupe, les couteaux et le bloc de tissu sont refroidis à -90°C à l’azote liquide pour la taille grossière (400 nm, 50 mm/s) des quatre côtés (couteau de tungstène) et de la face principale (couteau de verre). La température est ensuite abaissée à -115°C pour les coupes ultra fines (65 nm, 1 mm/s, couteau de diamant). Les coupes sont récupérées sur le
couteau avec un anneau retenant une goutte de méthyl cellulose–sucrose. Puis la goutte contenant la coupe est déposée sur la grille carbonée.
c. Immunomarquage à l’or
Les grilles sont déposées sur de la gélatine 2% côté coupe pour retirer la méthyl cellulose. La gélatine est chauffée à l’étuve (45-60°C) jusqu’à ce que les grilles soient bien mobiles à sa surface. Pour bien retirer toute la gélatine des grilles, elles sont incubées sur des gouttes de PBS–glycine 50 mM préalablement chauffée à l’étuve (sinon la gélatine se fige sur les grilles) trois à quatre fois 3 min (jusqu’à ce que les grilles soient bien mobiles sur la goutte de PBS-glycine). Les sites non spécifiques sont bloqués au PBS–BSA 10 mg/ml 15 à 20 min. Les coupes sont ensuite mises en présence de l’anticorps primaire dilué dans le tampon de saturation pendant 20 à 60 min. Après trois lavages de 3 min en PBS-BSA 1 mg/ml, les coupes sont incubées 30 min avec la protéine-A couplée à des billes d’or de 70 nm diluée dans le tampon de lavage. L’excédent est éliminé par quatre lavages de 5 min en PBS. Le marquage est fixé 5 min par de la glutaraldéhyde 1% diluée dans du PBS. Après trois fois 3 min de lavage au PBS et dix lavages d’1 min à l’eau, les coupes sont rincées deux fois 5 s puis 10 min, sur glace et à l’obscurité, en méthyl cellulose 2% acétate d’uranyl 0,4%. L’excès de méthyl cellulose est absorbé sur du papier Watman.