METHODES UTILISES AU LABORATOIRE

L’exploration d’une HbP exige une étude phénotypique, faisant appel à des techniques permettant le typage et la quantification des différentes fractions de l'Hb. Elle est fréquemment associée à une étude génotypique afin de confirmer le diagnostic établi.Dans cette partie du travail, nous présenterons les étapes d’investigation des HbP selon la démarche adoptée au laboratoire de biochimie de l’HMIMV de Rabat, conformément aux recommandations de la Nomenclature des Actes de Biologie Médicale (NABM).

II.1 Circonstances d’étude d’une anomalie de l’hémoglobine

Les circonstances menant à étudier une anomalie de l’Hb au laboratoire sont multiples et englobent [1, 11, 14,15] :

 La Présence de signes cliniques et/ou biologiques évocateurs d’une HbP:

o Des Anomalies cliniques, notamment un syndrome anémique (par extension devant une pâleur cutanéo-muqueuse, une dyspnée, une asthénie, un essoufflement…), une polyglobulie ou une cyanose (devant des céphalées, vertiges, acouphènes), ou bien des signes d’hémolyse (splénomégalie, lithiase vésiculaire),

o Des Anomalies biologiques, notamment de l’hémogramme (anémie, microcytose, pseudo polyglobulie), ou encore des anomalies morphologiques du GR à l’examen du frottis sanguin (Anisocytose, hématies cibles, drépanocytes, ponctuations basophiles, corps de Jolly…), ou des signes d’hémolyse (bilirubine libre augmentée, haptoglobine très diminuée, LDH élevée),

 Une enquête familiale suite à la mise en évidence d’une anomalie de l’Hb chez un membre de la famille,

 Dans le cadre d’un dépistage systématique chez des individus ayant une origine ethnique ou géographique dite « à risque ». L’HMIMV reçoit fréquemment des patients originaires des pays étiquetés à risque pour ce type de pathologie,

 À l’occasion d’un bilan d’aptitude chez le militaire ou d’un bilan préopératoire.  La recherche d’une anomalie de l’Hb devant un syndrome douloureux osseux ou abdominal,

 Un dépistage néonatal chez un sujet appartenant à une population à risque.  Un diagnostic prénatal conseillé lors d’une grossesse chez un couple à risque.

II.2 Démarche diagnostique au laboratoire (Figure 1)

II.2.1 Processus pré-analytique

II.2.1.1 Fiche d’exploitation

La demande d’étude de l’Hb doit s’accompagner obligatoirement de renseignements cliniques et biologiques pour une interprétation judicieuse des résultats. De ce fait, une fiche de recueil de données (Annexe 1) a été établie pour chaque patient lors de l’analyse de son dossier médical. Elle mentionne les points ci-après :

- Les données démographiques : sexe, âge, origine géographique ou ethnique,

- Les renseignements cliniques et thérapeutiques : motifs de consultation ou d’hospitalisation, antécédents familiaux, pathologies associées, notion de transfusion récente, notion de consanguinité dans le couple, traitement par un inducteur de l’HbF (hydroxyurée ou érythropoïétine) ou par le fer,

- Les résultats des examens biologiques pratiqués, particulièrement : o L’électrophorèse de l’hémoglobine à pH alcalin et/ou à pH acide, o Le résultat de la CLHP lorsqu’elle a été réalisée.

o Les examens hématologiques, notamment la Numération formule sanguine (NFS) avec les constantes érythrocytaires (VGM, TCMH…) afin d’identifier la présence d’une anémie et de préciser sa nature (microcytaire, hypochrome), le résultat du frottis sanguin (FS) pour mettre en évidence les anomalies morphologiques des hématies (globules rouges falciformés, anisopoїkilocytose, cellules cibles), de même que le test de falciformation si il était demandé,

o Les examens biochimiques complémentaires, notament le bilan martial; ferritine complétée par le dosage de la CRP pour exclure une carence martiale, le bilan de l’hémolyse (bilirubine, haptoglobine, LDH) lorsqu’il était réalisé.

L’interprétation de ces résultats permet d’établir un diagnostic étiologique, qui peut être complété par une étude génotypique si nécessaire.

II.2.1.2 Prélèvement du spécimen biologique

Les exigences pré-analytiques doivent être bien maîtrisées. En effet, l’étude phénotypique de l’Hb s’effectue sur un prélèvement de sang total recueilli sur un tube contenant un anticoagulant de type EDTA. L’acheminement du prélèvement au laboratoire doit se faire le plus rapidement possible.

Le prélèvement doit être frais ou à défaut conservé au réfrigérateur à 4°C pendant sept jours au maximum. La congélation est cependant à proscrire afin d’éviter l’hémolyse [1,13].

De même, la recherche d’une anomalie de l’Hb doit être pratiquée à distance de toute transfusion sanguine (3 mois minimum) et en absence de carence martiale de préférence [12].

Pour une étude de l’Hb, chaque patient doit présenter au total trois tubes sur lesquels sont mentionnés son identité, la date de naissance, l’identifiant patient (IPP), la date de prélèvement et le service prescripteur :

- Deux tubes prélevés sur EDTA (Bouchon violet), l’un est envoyé au laboratoire d’hématologie pour la réalisation de l’hémogramme, l’étude du FS et le test de falciformation. Le deuxième est acheminé au laboratoire de biochimie pour l’étude

- Un tube sec (Bouchon rouge) pour la réalisation des examens biochimiques complémentaires : bilan martial, bilan inflammatoire (CRP), bilan d’hémolyse (bilirubine, Haptoglobine, LDH).

- Pour certains patients, un troisième tube EDTA peut s’ajouter pour une étude génotypique. Celle-ci nécessite le consentement éclairé du patient ou des parents pour un mineur (Annexe 2) [9].

Figure 1 : Démarche diagnostique dans l’exploration d’une HbP au sein du Laboratoire de Biochimie de l’HMIMV-Rabat.

II.2.2 Processus analytique

La recherche d’une anomalie de l’Hb selon la Nomenclature des Actes de Biologie Médicale (NABM) doit inclure au minimum 3 tests phénotypiques distincts, dont au moins une technique électrophorétique et deux autres tests adaptés selon les besoins pour un résultat diagnostique d’orientation. Parmi les trois techniques utilisées, l’une doit être quantitative pour pouvoir doser précisément les fractions mineures (HbA2 et HbF). De ce fait, seules la CLHP et l’électrophorèse capillaire (ECAP) sont acceptables [12].

Le laboratoire de Biochimie recourt à une complémentarité d’examens et d’outils pour l’étude de l’Hb.

Dans les paragraphes qui suivront, nous allons décrire brièvement les différentes techniques utilisées dans le présent travail.

II.2.2.1 Techniques de diagnostic phénotypique d’une anomalie de l’Hb