Mesures spectroscopiques bimodales

Jusqu’à présent, une seule étude [Diagaradjaneet al., 2005] a été publiée sur la spectroscopie optique associée à l’évaluation histologique de la cancérogenèse chimiquement induite sur la peau de souris. L’un des principaux résultats de cette étude est que l’utilisation de plusieurs longueurs d’onde d’excitation d’AF améliore la précision de la classification des états précoces de CE com-paré à l’utilisation d’une seule longueur d’onde d’excitation.

Dans les sections suivantes nous détaillons la mise en place des mesures en spectroscopie bimodale, en décrivant la configuration instrumentale retenue, la préparation des animaux et l’acquisition des spectres.

3.3.1 Configuration instrumentale

Pour le protocole mis en place, les caractéristiques retenues pour l’instrumentation (figure 2.8) décrite dans le chapitre 2 de ce travail de thèse sont les suivantes :

– Pour la spectroscopie d’autofluorescence : 7 pics d’excitation centrés à 360, 368, 390, 400, 410, 420, et 430 nm (figure 3.2a).

– Pour la spectroscopie de diffusion élastique : 3 bandes d’excitation chevauchantes 365-545, 450-640 et 550-740 nm (figure 3.2b).

– Pour la résolution spatiale, nous avons choisi de façon arbitraire 6 fibres de réception (figure 3.3, fibres : 33, 16, 30, 19, 8 et 26) situées à 5 distances différentes de la fibre d’excitation (2 x 271, 536, 834, 1076 et 1341µm).

– Le spectromètre iHR320 et le détecteur ont été configurés pour l’acquisition de 6 spectres sur les voies 2, 4, 6, 8, 10 et 12 de la matrice CCD, avec une largueur de fente d’entrée de 1 mm pour les acquisitions en AF et de 0.01 mm pour les acquisitions en RD avec des temps d’intégration de 500 ms et de 50 ms respectivement.

Figure3.2 – Spectres d’intensité d’excitation choisis pour la spectroscopie d’autofluorescence et de réflectance diffuse respectivement : a) 7 longeurs d’onde d’excitation pour l’AutoFluorescence : 360, 368, 380, 390, 400, 410, 420 et 430 nm ; b) 3 bandes d’illumination pour la Réflectance Diffuse : 365-545, 450-640 et 550-740 nm

Figure 3.3 – Configuration géométrique de l’extrémité distale de la sonde multi-fibres. Pour notre étude in vivo la fibre 32 a servi pour l’excitation et les fibres 8, 16, 19, 26, 30 et 33 pour la réception.

3.3.2 Préparation des animaux

Avant toute mesure spectroscopique, chaque souris a suivi une préparation afin d’assurer l’efficacité et la fiabilité du protocole (pesée, calcul de dose d’anesthesique). Durant l’anesthé-sie (environ 75 minutes), les souris sont allongées sur une couverture chauffante (Température Control Unit HB 101/2, Vitrolles, Bioseb) fixée à 35° C.

La méthode d’induction de tumeurs cutanées "spontanées" choisie implique une difficulté technique à savoir l’ignorancea priori des localisations tumorales. L’enjeu dans ce cas est donc de pouvoir sonder une portion significative du corps de l’animal soumis à irradiation afin d’obtenir une densité de points de mesure suffisante et en un temps compatible avec une durée d’anesthésie non létale pour l’animal. D’après la littérature, les tumeurs se développent préférentiellement dans la zone médiane à proximité de la colonne vertébrale. Nous avons donc choisi de concentrer notre exploration sur la moitié de la surface soient 12 sites anatomiques de mesure (6 de chaque côté le long de la colonne vertébrale) représentés schématiquement en figure 3.4. Un contrôle intra-individuel de peau saine est nécessaire et pour cela la peau du ventre est également sondée (6 points de mesure).

Figure 3.4 – Localisation schématique des sites anatomiques de mesure en spectroscopie bimo-dale sur la peau de souris : a) 12 sites sur le dos (6 le long de la colonne vertébrale) ; b) 6 sites sur le ventre.

Pour repérer de manière fiable les sites anatomiques de mesure, un cache translucide est fixé sur le dos des souris a l’aide de sparadrap micro-poreux afin de ne pas les blesser (Figure 3.5). Il s’agit d’un rectangle en plastique de 2x3 cm2, comprenant quatre rangées de 6 trous de 3 mm de diamètre. Les centres de ces trous sont espacés de 5 mm laissant ainsi un espace de 2 mm entre les trous (Figure 3.6).

Figure 3.5 – Photographie d’une souris anesthésiée installée sur la couverture chauffante et portant sur le dos le cache troué fixé à l’aide de sparadrap.

Figure3.6 – Schéma du cache en plastique translucide utilisé pour repérer les sites anatomiques de mesures spectroscopiques.

3.3.3 Acquisition des spectres

Un certain nombre de précautions doivent être prises afin de réaliser l’acquisition des spectres dans des conditions de mesures correctes et fiables.

Un première contrainte concerne le placement de la sonde à fibres optiques sur la peau de la souris et en particulier la difficulté de réaliser des mesures dans des conditions de répétabilité acceptables c’est à dire avec le même angle et la même pression de la sonde sur le tissu. Pour contrôler l’angle et éviter des mouvements incontrôlés pouvant donner des acquisitions erronées ou déviées, la sonde à fibres optiques est fixée sur une platine de translation motorisée (figure 3.6). L’angle par rapport à la surface dorsale de la souris est fixe et égal à 90°. La pression est estimée visuellement, la sonde placée au contact de la peau des souris induit une dépression du tissu de quelques millimètres (2 à 3 mm environ). Le réglage de la position de descente de la sonde est effectué logiciellement avec des déplacements de 5 mm et 0.5 mm.

Une seconde contrainte est liée aux perturbations de la lumière ambiante sur les spectres acquis. Pour éviter ces perturbations, nous avons réalisé les mesures spectroscopiques en totale obscurité, c’est-à-dire, avec les lumières de la salle d’expérimentation éteintes et une toile noire recouvrant l’espace de mesure évitant ainsi les perturbations dues à la présence des LEDs sur les différents instruments utilisés dans l’expérimentation.

Protocole de mesures spectroscopiques

Les mesures ont été réalisées sur la peau irradiée et non irradiée des souris tous les 2 jours, chaque semaine d’avril à octobre 2007.

Chaque souris est anesthésiée, placé sur une couverture chauffante puis le cache troué est fixé sur son dos à l’aide du sparadrap.

La sonde à fibres optiques est alors placée en contact sur le tissu et la pression est ajustée visuellement en contrôlant le déplacement de la platine motorisée sur laquelle est fixée la fibre et en bougeant la couverture chauffante pour placer correctement le site de mesure. La pression de la sonde sur la peau de la souris est réglée en montant ou en baissant la sonde par pas de

0.5mm de façon automatique.

Suite au placement de la sonde sur le site de mesure, les dix différentes mesures en spec-troscopie bimodale sont lancées. Les 7 excitations en AF et les 3 bandes d’excitation pour la diffusion élastique, multipliées par trois accumulations pour chaque, prennent au total près de 3 minutes. Les spectres acquis sont enregistrés de façon automatique dans des fichiers Excel sous la forme de matrices 2D : valeurs d’intensités en lignes et excitation et nombre d’accumulation correspondante en colones.