Chapitre V : Mesures de Forces Impliquant des Rétinoïdes
3. Mesures de forces entre une monocouche de lipide rétinoïde et une couche de
Dans cette partie nous présentons les premières mesures de forces obtenues entre une monocouche de lipide rétinoïde et une monocouche de lipide NTA-Ni recouverte de récepteurs RXR. Le lipide rétinoïde et le lipide NTA-Ni étaient tous les deux déposés à la pression de 35 mN/m et les expériences étaient réalisées dans une solution de Tris 10 mM. Ici, nous ne pouvions pas utiliser le même protocole expérimental afin de fonctionnaliser les monocouches de lipide NTA-Ni. En effet, en injectant le récepteur directement dans la cuve du SFA, on risquait de le voir venir s’accrocher également sur
la monocouche de lipide rétinoïde, ce qui aurait rendu impossible la mesure de forces entre le récepteur et son ligand. Nous avons donc préféré laisser incuber la lentille sur laquelle la bicouche DMPE/NTA-Ni avait été déposée dans un petit “bécher” de 5 ml contenant une solution du récepteur RXR à 1 µM (75 µl d’une solution mère de récepteur RXR à 2 g/l avait été préalablement diluée dans 5 ml de Tris et cette solution avait été filtrée à 0,1 µm). Nous laissions diffuser le récepteur pendant environ 1 heure puis nous rincions la lentille en la plongeant dans un grand “bécher” de 100 ml. La lentille était alors fixée comme d’habitude dans la cuve du SFA et les mesures étaient entreprises.
Les mesures de forces ont été réalisées en différents endroits de la monocouche. Selon la position choisie et selon le temps d’attente avant le lancement des mesures, deux profils de force différents ont été obtenus. Pour chaque position testée on réalisait plusieurs allers-retours successifs en pressant à chaque fois un peu plus les deux surfaces l’une contre l’autre. Sur la première mesure réalisée (triangles de la figure V- 11), la distance de contact correspondait à 2 tailles de récepteur (plus celle des deux monocouches de lipide rétinoïde et NTA-Ni), c’est-à-dire environ 15 nm. Contrairement à ce qui avait été observé entre des monocouches recouvertes de récepteurs, la cinétique de séparation des surfaces a mis ici en évidence un phénomène adhésif. La force mesurée lors de la séparation diminuait progressivement au début mais rejoignait la ligne de base (force nulle) par un saut d’environ 20 nm (saut adhésif). La constante de raideur du ressort utilisé étant de 1680 N/m et les surfaces d’étude ayant un rayon de courbure de 2 cm, ceci correspond à une force de séparation de l’ordre de 2 mN/m. Pour confirmer ce résultat nous devrons travailler avec un ressort de constante de raideur plus faible et essayer d’obtenir davantage de points dans la région des distances proches du saut adhésif, c’est-à-dire entre 20 et 40 nm.
Sur les mesures suivantes, lorsque la force maximale imposée dépassait 20 mN/m, la distance de contact diminuait. Les récepteurs étaient alors expulsés hors de la zone de contact entre les deux surfaces.
Si nous testions une nouvelle position sur la monocouche immédiatement après, sans laisser le temps aux récepteurs de se réorganiser, la distance de contact correspondait plutôt à 1 taille de récepteur (plus celle des deux monocouches), soit environ 10 nm
(ronds de la figure V-10). Nous observions également dans ce cas un petit saut adhésif de l’ordre de 20 nm.
Si nous attendions environ 30 min après avoir changé de position et avant de lancer une nouvelle mesure, nous retrouvions la distance de contact initiale, c’est-à-dire 15 nm (courbe équivalente à celle symbolisée par les triangles de la figure V-11).
-5 0 5 10 15 0 20 40 60 80 10 F/ R ( m N/m) Distance (nm) Sauts adhésifs ? -5 0 5 10 15 0 20 40 60 80 10 F/ R ( m N/m) Distance (nm) Sauts adhésifs ? Sauts adhésifs ? 00
Figure V-11 : Mesures de forces dans le Tris entre une monocouche de lipide rétinoïde et une monocouche de lipide NTA-Ni recouverte de récepteurs RXR. Les deux profils (triangles et ronds) sont issus de la même expérience. Dans le cas du profil symbolisé par les triangles, la monocouche de lipide NTA-Ni est recouverte de dimères des récepteurs RXR et dans le cas du profil symbolisé par les ronds,
elle est recouverte de monomères. Rapprochement des surfaces : symboles pleins, séparation des surfaces : symboles vides.
Il semblerait donc que les monocouches de lipide NTA-Ni soient initialement recouvertes de dimères des récepteurs (figure V-12a) puis que la série de mesures réalisée perturbe cette organisation pour ne laisser qu’une seule couche de récepteur à la surface des monocouches (figure V-12b). En attendant plus longtemps avant de lancer une nouvelle série de mesures, on laisse le temps aux récepteurs de se réorganiser et on retrouve l’organisation en dimères.
Une petite adhésion a donc pu être observée entre le récepteur RXR et son ligand. Le saut hors du contact (saut adhésif) était de l’ordre de 20 nm, ce qui correspond, compte
tenu de la raideur du ressort utilisé, à une force de séparation de l’ordre de 2 mN/m. Ce résultat nécessite d’être confirmé et notamment il faudra réaliser une étude plus fine de la phase de séparation entre les deux surfaces. La prochaine mesure sera donc réalisée avec un ressort ayant une constante de raideur 10 fois plus faible et tentera de faire apparaître davantage de points expérimentaux dans la région proche du saut adhésif.
Lipide NTA-Ni Lipide rétinoïde RXR (a) (b) Lipide NTA-Ni Lipide rétinoïde RXR (a) (b)
Figure V-12 : Configurations expérimentales supposées lors des mesures de forces entre une monocouche de lipide rétinoïde et une monocouche de lipide NTA-Ni recouverte de récepteurs RXR. Après réorganisation, les récepteurs se fixent sous la forme de dimères (a). Les perturbations générées
par la série de mesures de forces peuvent détruire cette organisation en ne laissant qu’une seule couche de récepteurs en surface (b).