Mesures de fluorescence en temps réel

Afin de valider si la nouvelle version du module de fluorescence permet de détecter la fluorescence de fluorophores adsorbés à la surface du capteur, des solutions de différentes

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concentrations de R6G ont été injectées successivement à la surface du capteur. Chaque injection de fluorophore a été précédée d’un minutieux rinçage avec de l’eau déionisée afin de retirer toute trace de R6G dans la cellule de mesure. Pour ce volet de l’expérience, la détection s’est faite par fluorescence et non par SPR. La diode laser a été utilisée à pleine puissance pour l’acquisition des mesures de fluorescence. Ainsi, le signal mesuré par l’APD a été sauvegardé en temps réel pour toute la durée de l’expérience durant laquelle les différentes solutions de R6G ont été injectées. La cinétique est montrée à la figure 7.9.

Figure 7.9 : Signal fluorescent en temps réel pour l’injection des différentes solutions de R6G sur l’assemblage polymérique.

Dans la figure précédente, il est possible d’observer la variation du signal mesuré par l’APD au fil du temps. Les w symbolisent l’injection d’eau déionisée avant et après chaque injection de R6G et le les * dénotent les injections des différentes solutions de R6G. La concentration en micromolaire est indiquée à droite des *. Cet essai a permis d’observer deux types de détection : la fluorescence de la rhodamine 6G en solution et celle en surface. La fluorescence mesurée dans les solutions de fluorophores est en effet principalement générée par les fluorophores libres en solution, tandis que les lectures de fluorescence obtenues par après lors du rinçage avec l’eau déionisée sont issues des

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fluorophores résiduels adsorbés au capteur. Tel qu’attendu, l’intensité de fluorescence associée aux fluorophores adsorbés est beaucoup plus faible que celle mesurée lorsque les solutions de R6G remplissent la cellule de mesure. Trois essais ont été réalisés afin de juger de la reproductibilité des signaux mesurés. La figure 7.10 montre deux courbes obtenues à partir des résultats bruts mesurés.

Figure 7.10 : Signal normalisé moyen mesuré par l’APD pour les différentes concentrations de R6G injectées. Le graphique A montre les valeurs obtenues pour la fluorescence mesurée dans les solutions de fluorophores, tandis que le graphique B montre celles obtenues après le rinçage de chacune des solutions par l’eau déionisée. Les barres d’erreur correspondent à l’écart-type sur chacune des mesures.

Les valeurs présentées dans la figure 7.10 sont normalisées par rapport à la valeur obtenue pour la solution la plus concentrée, car pour l’un des trois capteurs testés, une différence était notable dans les lectures de fluorescence. En effet, les signaux mesurés étaient significativement plus faibles que pour les deux autres essais. Cette différence provient probablement d’un ajustement de la distance entre le capteur et le module de fluorescence non optimal, menant à une sensibilité moindre pour l’un des trois essais. Le panneau A montre la fluorescence mesurée pour les différentes solutions de fluorophores en solution. Les solutions de R6G utilisées avaient des concentrations de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 25 et 50 µM. La linéarité obtenue pour la figure A est très bonne dans l’intervalle de concentration de 0,1 à 25 µM et la déviation à 50µM s’explique par l’auto-désactivation de la R6G à plus haute

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Signal normalisé

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B

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concentration. La précision des mesures de fluorescence prises en solution est également très bonne, avec des barres d’erreur très faibles.

Le graphique du panneau B montre de son côté les résultats de fluorescence obtenus après le rinçage des différentes solutions de fluorophores injectées. Ainsi, la fluorescence mesurée devrait uniquement provenir des fluorophores adsorbés à la surface du capteur. Dans ce cas, la linéarité est moins bonne que pour les mesures du graphique A, mais l’intensité mesurée pour des concentrations croissantes de R6G augmente néanmoins. Deux facteurs peuvent potentiellement expliquer l’absence de linéarité observée dans le graphique B. En premier lieu, comme les fluorophores sont confinés à la surface du capteur, la distance entre eux est petite plus faible que lorsqu’ils sont en solution. Leur auto- désactivation se produit donc peut-être à de plus faible concentration dans ce cas et le signal mesuré ne serait donc pas linéaire avec l’augmentation de la concentration de R6G. En effet, ce phénomène est observé notamment pour l’imagerie de biomolécules121_{. Les fluorophores s’agrègent en effet à la} surface des protéines et forment des zones très denses en fluorophores qui favorisent l’auto- désactivation de fluorescence plutôt que le processus radiatif. Les fluorophores organiques, étant souvent constitués de cycles aromatiques, sont sujet à des empilements-π, ce qui leur permet de s’accumuler dans de très petites zones. Un autre facteur à tenir en compte est l’adsorption. Comme on mesure la fluorescence provenant de fluorophores adsorbés à la surface du capteur, le signal résultant peut être décrit par une isotherme d’adsorption. La figure suivante montre la modélisation de Langmuir avec les données expérimentales.

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Figure 7.11 : Modélisation de l’isotherme de Langmuir à partir des données de fluorescence expérimentales pour les fluorophores liés à la surface du capteur. (R2_=0,977)

Dans la figure précédente, on constate que les valeurs obtenues correspondent effectivement assez bien au comportement prédit par l’isotherme de Langmuir. Il est même possible d’extraire une valeur de KD d’environ 16 µM pour l’adsorption de la rhodamine 6G à l’assemblage de polyélectrolytes. Toutefois, l’isotherme de Langmuir est basée sur des postulats impliquant notamment que l’analyte a une affinité équivalente pour chaque site du substrat et qu’il se forme une monocouche d’adsorbat. Les assemblages de polyélectrolytes formés ne sont pas rigoureusement uniformes sur l’ensemble du capteur, donc il est probable que l’affinité de l’analyte soit mieux représentée par une distribution de valeurs plutôt que par une unique valeur. Également, les molécules de R6G peuvent s’agréger par empilement-π122_{. L’adsorption de la R6G aux bicouches de polyélectrolytes n’est probablement pas} idéalement décrite par l’isotherme de Langmuir, mais au besoin des isothermes plus complexes comme celle de Freundlich ou celle de Frumklin-Fowler-Guggenheim peuvent être utilisées pour modéliser des processus d’adsorption plus complexes.

En plus de cette linéarité moindre, les résultats du panneau B de la figure 7.10 ont des barres d’erreur beaucoup plus grandes que celles associées aux mesures de fluorescence du panneau A. Les mesures du panneau B sont issues des molécules de R6G liées à la surface de trois capteurs différents. Puisque l’assemblage de polyélectrolyte n’est pas parfaitement uniforme, il est possible qu’une

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certaine variabilité existe entre les différents capteurs utilisés et que les signaux mesurés fluctuent beaucoup plus d’un capteur à l’autre. Les mesures en solution ne sont pas sujettes à cette variabilité, puisque le signal mesuré provient principalement des fluorophores en solution dans la cellule de mesure.